孟富慧，　陳　利，　徐　適，　鮮　明，　張　輝，　李建華，　董　頎，　楊春濤△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣東 廣州 511436； 2華盛頓州立大學(xué)化學(xué)教研室，美國 華盛頓州 普爾曼市 99164)

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四硫代鉬酸銨作為新型硫化氫供體的鑒定及其對皮膚細胞的保護作用*

孟富慧1，陳利1，徐適2，鮮明2，張輝1，李建華1，董頎1，楊春濤1△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣東 廣州 511436；2華盛頓州立大學(xué)化學(xué)教研室，美國 華盛頓州 普爾曼市 99164)

[摘要]目的： 本研究旨在檢測金屬絡(luò)合物四硫代鉬酸銨(ATTM)的硫化氫(H2S)釋放能力并進一步觀察其減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚細胞損傷的作用。方法：反應(yīng)瓶法檢測ATTM在細胞培養(yǎng)基中釋放的H2S，二氯二氫熒光素二乙酸酯或羅丹明123染色結(jié)合熒光顯微鏡照相術(shù)分別檢測細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的含量和線粒體膜電位(ΔΨm)，用試劑盒檢測細胞存活率和乳酸脫氫酶(LDH)的釋放。結(jié)果：與H2S供體GYY4137類似，ATTM在細胞培養(yǎng)基中可劑量依賴性地釋放H2S。在25～400 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，ATTM處理對人皮膚細胞(HaCaT細胞)的存活率無明顯影響(P>0.05)。紫外線照射或外源性給予ROS供體(過氧化氫，H2O2)處理均可增加HaCaT細胞內(nèi)ROS的含量。400 μmol/L H2O2處理可明顯降低HaCaT細胞的存活率(P<0.01)，而在H2O2處理前給予ATTM預(yù)處理，細胞存活率明顯提高，其中在100和200 μmol/L濃度時ATTM具有最好的細胞保護作用(P<0.01)。400 μmol/L H2O2處理還可損害細胞的ΔΨm和細胞膜并使LDH釋放增加(P<0.01)。而在細胞遭受損傷前給予200 μmol/L ATTM預(yù)處理可明顯改善ΔΨm的水平(P<0.05)并抑制LDH從細胞內(nèi)釋放(P<0.01)。結(jié)論：ATTM具有釋放H2S的能力并可保護人皮膚細胞對抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]HaCaT細胞； 硫化氫； 四硫代鉬酸銨； 氧化應(yīng)激

硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide，NO) 和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，在體內(nèi)起著廣泛的生理及病理作用，具有重要的研究價值和臨床應(yīng)用前景。其效應(yīng)主要涵蓋了舒張血管降低血壓、抑制氧/硝化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、對抗缺血-再灌注引起的器官損傷、調(diào)節(jié)胰島素的分泌和受體敏感性等[1]。亞硝基鐵氰化鈉，也稱硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP),是NO的重要供體，降壓起效快、體內(nèi)代謝迅速，雖然其還存在很多問題，如靶向性差，毒性較大，釋放過快，易耐受，但是其作為一種相對較好的NO供體已被臨床用來治療高血壓急癥和急性左心衰等[2]。然而，目前為止還沒有相對較好的H2S供體可以被臨床應(yīng)用。

目前市面上可以獲得的H2S供體存在著種種缺陷限制了其在臨床上的應(yīng)用。因而尋找較為合理可行的H2S供體具有重要的意義[3]。本研究用一種傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)簡單的金屬絡(luò)合物四硫代鉬酸銨(ammonium tetrathiomolybdate，ATTM)，檢測了其H2S的釋放能力并在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚細胞損傷模型上觀察了其細胞保護作用。

材料和方法

1實驗材料

ATTM、H2S供體GYY4137和二氯二氫熒光素二乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)購自Sigma；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit, CCK)-8、羅丹明(rhodamine, Rh)123線粒體染料和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒購自Dojindo；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)及其它化合物購自廣州化學(xué)試劑廠。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)HaCaT皮膚細胞來源于自發(fā)轉(zhuǎn)化的人腹部表皮，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。此細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。傳代時用0.25%胰蛋白酶消化5 min，每隔2 d傳代1次。

2.2硫化氫釋放的檢測如圖1所示，將2 mL無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的ATTM或GYY4137加到反應(yīng)瓶的周圍池(A)，并向中央池(B)加入500 μL 4% NaOH溶液以吸收釋放的H2S氣體，于37 ℃輕搖2 h。反應(yīng)結(jié)束后，從中央池吸取400 μL NaOH溶液，隨機加入等物質(zhì)的量的濃鹽酸使之中和，而后迅速依次加入40 μL 20 mmol/L N,N-二甲基-對苯二胺鹽酸鹽(用7.2 mol/L 的濃鹽酸配制)和40 μL 30 mmol/L 三氯化鐵(用1.2 mol/L 的濃鹽酸配制)，室溫反應(yīng)10 min。每個樣品取100 μL的反應(yīng)液加至96孔培養(yǎng)板的孔中，用酶標(biāo)儀讀取670 nm波長處的吸光度。

Figure 1.The absorption of released H2S gas in reaction bottles. A: the lateral pool; B: the central pool.

圖1在反應(yīng)瓶中檢測釋放出的硫化氫氣體

2.3細胞活力的檢測將HaCaT 皮膚細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔約1×105個，每組4個復(fù)孔。當(dāng)細胞生長至80%融合時，給予不同濃度的ATTM或在ATTM預(yù)處理1 h后給予400 μmol/L H2O2處理5 h，參考本實驗室以前的研究[4]。在處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered solution, PBS)洗1次，每孔加入1∶10稀釋的CCK-8溶液100 μL，37 ℃ 孵育3 h，用酶標(biāo)儀讀取各孔在450 nm波長處的吸光度，取其平均值，按如下公式計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%，重復(fù)6次。

2.4線粒體膜電位和細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的檢測細胞線粒體可依靠其膜的電負性攝取陽離子熒光染料Rh123，攝取量依賴于線粒體膜電位(mitochondria membrane potential，ΔΨm)。細胞ΔΨm受損可致Rh123攝取能力減弱，因而根據(jù)Rh123的攝取量可以間接反映線粒體的功能狀況。將HaCaT 皮膚細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，當(dāng)細胞生長至80%融合時給予400 μmol/L H2O2處理5 h和/或200 μmol/L ATTM預(yù)處理1 h。處理完成后，用PBS漂洗1次，加入無FBS培養(yǎng)基配制的10 mg/L Rh123，在37 ℃避光孵育30 min。用熒光顯微鏡隨機選取6個視野進行攝片，并用ImageJ軟件對熒光強度進行半定量分析。細胞內(nèi)ROS檢測方法類似于ΔΨm的檢測，ROS可將無熒光的DCFH氧化生成綠色熒光的DCF，通過在顯微鏡下觀察綠色熒光的強度可以間接反映ROS的相對含量。HaCaT皮膚細胞經(jīng)紫外線照射或H2O2處理1 h后，用PBS漂洗1次，加入無FBS培養(yǎng)基配制的10 μmol/L DCFH-DA，在37 ℃避光孵育20 min，用熒光顯微鏡進行攝片。

2.5乳酸脫氫酶釋放的檢測將HaCaT 皮膚細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞生長至80%融合時,給予400 μmol/L H2O2處理5 h和/或200 μmol/L ATTM預(yù)處理1 h。在細胞受損時，細胞膜通透性增加可致LDH從細胞內(nèi)釋放至細胞外，因而通過檢測LDH的釋放率可以反映細胞的受損程度。收集各培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，并向每孔加入100 μL的細胞裂解液裂解細胞，按照試劑盒說明書分別檢測培養(yǎng)基中和細胞內(nèi)LDH的含量。LDH的釋放率可按照如下公式計算，LDH釋放率(%)= LDH培養(yǎng)基/(LDH培養(yǎng)基+ LDH細胞內(nèi))×100%，重復(fù)6次。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1四硫代鉬酸銨的硫化氫釋放效應(yīng)

在500～1 500 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著ATTM濃度的增加，生成的H2S也呈濃度依賴性地增加。另外，GYY4137是目前常用的H2S供體，用此方法，也觀察到其可以濃度依賴性地釋放H2S。此結(jié)果提示，ATTM具有釋放H2S的能力，且效果略微好于GYY4137，見圖2。

2四硫代鉬酸銨對細胞活力的影響

雖然ATTM具有H2S釋放的能力，但是為了明確其能否被用于生物系統(tǒng)前，需先評價其細胞毒性作用。不同濃度的ATTM處理HaCaT皮膚細胞1 h，而后繼續(xù)培養(yǎng)5 h；或連續(xù)處理24 h。用CCK-8實驗檢測細胞活力顯示，在25～400 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，ATTM處理對HaCaT細胞活性均無明顯影響。

Figure 2.H2S release from the indicated donors in reaction bottles. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖2不同類型硫化氫供體在反應(yīng)瓶中釋放硫化氫

Figure 3.The effects of ATTM on the viability of HaCaT cells. The cells were treated with 25～400 μmol/L ATTM for 1 h followed a 5-h culture or for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=6.

圖3不同濃度的四硫代鉬酸銨對HaCaT皮膚細胞活性的影響3紫外線照射和H2O2處理可提高皮膚細胞內(nèi)活性氧的含量

紫外線照射是引起皮膚細胞受損的重要原因，而氧化應(yīng)激是其損傷的重要的機制。用DCFH染色結(jié)合熒光顯微鏡照相，檢測細胞內(nèi)ROS顯示，HaCaT細胞經(jīng)紫外線照射1 h，細胞內(nèi)ROS的水平較正常培養(yǎng)的細胞明顯提高。另外，給予ROS的常用供體H2O2(400 μmol/L)處理1 h也可使細胞內(nèi)的ROS水平提高，見圖4。

Figure 4.The effects of the indicated treatments on intercellular ROS levels in the HaCaT cells. DCFH staining followed by photofluorography for the observation of ROS levels in the cells.

圖4不同處理因素對HaCaT皮膚細胞內(nèi)活性氧水平的影響

4四硫代鉬酸銨抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細胞受損

如圖5，在用400 μmol/L H2O2處理HaCaT皮膚細胞5 h前，用50～400 μmol/L ATTM預(yù)處理細胞1 h，檢測細胞活性顯示，在100～200 μmol/L ATTM預(yù)處理可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷(P<0.01)。

Figure 5.The effects of pretreatment with ATTM on H2O2-induced cell injury. HaCaT cells were exposed to 400 μmol/L H2O2for 5 h in the absence or presence of preconditioning with ATTM at different concentrations for 1 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsH2O2alone group.

圖5四硫代鉬酸銨預(yù)處理對過氧化氫誘導(dǎo)的HaCaT皮膚細胞受損的的影響

5四硫代鉬酸銨改善過氧化氫引起的線粒體功能障礙

線粒體是對傷害性刺激較為敏感的細胞器之一，通過檢測其對熒光染料Rh123的攝取情況可以反映其功能狀態(tài)。正常HaCaT皮膚細胞具有較強的Rh123攝取能力，而經(jīng)400 μmol/L H2O2處理5 h后其對Rh123的攝取明顯減弱(P<0.01)，提示ΔΨm受損。在用H2O2損傷細胞前給予200 μmol/L ATTM預(yù)處理1 h，可部分拮抗H2O2引起的ΔΨm減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The effects of pretreatment with ATTM on H2O2-induced mitochondrial dysfunction. HaCaT cells were exposed to 400 μmol/L H2O2for 5 h in the absence or presence of preconditioning with 200 μmol/L ATTM for 1 h. Rh123 staining followed by photofluorography was conducted for the observation of MMP levels in the cells. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsH2O2.

圖6四硫代鉬酸銨預(yù)處理對過氧化氫誘導(dǎo)的HaCaT皮膚細胞線粒體功能障礙的影響

6四硫代鉬酸銨抑制過氧化氫誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶過度釋放

在正常情況下LDH主要分布在細胞內(nèi)，當(dāng)細胞受損細胞膜通透性增加時，LDH可被釋放到細胞外，因而通過檢測LDH的釋放情況可以反映細胞膜的受損程度。圖7顯示，HaCaT皮膚細胞經(jīng)400 μmol/L H2O2處理5 h，可使LDH的釋放明顯增加(P<0.01)；而在H2O2處理前給予200 μmol/L ATTM預(yù)處理1 h，LDH的釋放被顯著減少，提示細胞膜受損得到改善(P<0.01)。

Figure 7.The effects of pretreatment with ATTM on H2O2-induced LDH release. HaCaT cells were exposed to 400 μmol/L H2O2for 5 h in the absence or presence of preconditioning with 200 μmol/L ATTM for 1 h. LDH release was measured by a commercial kit. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsH2O2.

圖7四硫代鉬酸銨預(yù)處理對過氧化氫誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶釋放的影響

討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)基中ATTM具有釋放H2S的能力。更重要的是，在氧化應(yīng)激引起的皮膚細胞損傷中，其不僅能改善細胞活力，還能提高線粒體功能并維持細胞膜的通透性。本文的發(fā)現(xiàn)可為ATTM的未來臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供有價值的依據(jù)。

氧化應(yīng)激介導(dǎo)的皮膚細胞損傷是常見的皮膚受損機制，如在紫外線照射、缺氧以及糖尿病皮膚潰瘍等病理生理過程中均存在皮膚細胞的氧化應(yīng)激損傷[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在人皮膚HaCaT細胞受到紫外線照射時，細胞內(nèi)的ROS水平明顯升高。用活性氧的常用供體H2O2處理HaCaT細胞也可使細胞內(nèi)的ROS水平升高。因而，用H2O2處理HaCaT細胞模擬其它各種類型的皮膚細胞受損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理可使細胞的存活率明顯降低，這與以前在其它類型的細胞報道相一致[7]。線粒體是細胞的能量工廠，也是細胞內(nèi)對傷害性刺激最為敏感的細胞器之一，本研究證實HaCaT細胞經(jīng)H2O2處理后，線粒體的功能明顯減低，表現(xiàn)為其對嗜線粒體染料的攝取明顯減少，Adlam等[8]的報道支持本文的研究。細胞受損還表現(xiàn)為細胞膜的損害，通透性的增加，細胞內(nèi)成分的外漏[7]，本研究的另一個發(fā)現(xiàn)是，H2O2處理可促進LDH從細胞內(nèi)釋放至細胞外的培養(yǎng)基中，提示細胞膜明顯受損?？傊?，H2O2處理可導(dǎo)致HaCaT細胞的存活率降低、線粒體功能障礙以及細胞膜的通透性增高，因而，H2O2處理的人皮膚HaCaT細胞或許可以成為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚損害的簡易模型。

眾所周知，SNP作為NO的供體，在高血壓急癥以及急性左心衰中已被廣泛應(yīng)用。H2S作為繼NO和CO之后的又一重要信號分子也逐漸被重視，其供體有早期的S2-及其酸式鹽(Na2S和NaHS)、化學(xué)合成自發(fā)水解的供體(GYY4137)和巰基激活的可控性供體(8A和8L)，然而，這些供體始終無法讓人滿意。如S2-類供體，在空氣中極易被氧化，其釋放H2S基本上是在瞬間完成的；GYY4137是第一個合成的H2S供體，然而其釋放H2S的速度和效率也不高，釋放靠自發(fā)水解實現(xiàn)[9]，無法人為干預(yù)并且其分解產(chǎn)物是除草劑的重要成分，可能會影響其廣泛應(yīng)用；8A和8L的合成已經(jīng)部分克服了上述供體的缺點，如此類化合物在空氣中較為穩(wěn)定，釋放效率較高。另外，可以根據(jù)加入巰基化合物的量控制其釋放H2S的速度。然而，由于其釋放需要額外加入L-半胱氨酸或還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)[10]，這在某些病理情況下(如缺氧、糖尿病時GSH本來就被嚴(yán)重消耗)可能是不利的。ATTM在化學(xué)結(jié)構(gòu)特點上與SNP有極大的相似性(圖8)，如兩者都是過渡金屬形成的絡(luò)合物，而且此二種過度金屬都為人體的必須元素并具有重要的生理功能。

Figure 8.Structure of SNP (A) and ATTM (B).

圖8硝普鈉和四硫代鉬酸銨的結(jié)構(gòu)

本研究接著在上述皮膚氧化應(yīng)激損傷模型，觀察ATTM的細胞保護作用。為此，首先檢測ATTM可否產(chǎn)生H2S。與理論預(yù)測相符，ATTM在細胞培養(yǎng)基中可以釋放出H2S，而且其釋放效率略強于GYY4137。若在皮膚細胞遭受氧化應(yīng)激前給予ATTM預(yù)處理，可以明顯減輕細胞的損傷效應(yīng)，這和本小組以前在其它類型H2S供體誘導(dǎo)的皮膚細胞損傷的報道類似[11]。另外，周萍萍等[12]在糖尿病大鼠傷口愈合障礙模型的研究也支持本文的發(fā)現(xiàn)。本文推測，這種效應(yīng)在日常生活中也許具有重要意義，如將此類化合物加入防曬霜中將可以減輕紫外線等誘導(dǎo)的皮膚細胞氧化損傷。另外，通過觀察細胞的線粒體功能，還發(fā)現(xiàn)ATTM和其它類型的H2S供體一樣，具有改善線粒體功能的作用[13]。在細胞受到ROS攻擊時，細胞膜可作為第一道屏障系統(tǒng)發(fā)揮防御功能，但是過多的ROS常對細胞膜造成脂質(zhì)過氧化損傷，引起通透性增加，細胞內(nèi)成分外漏。本研究通過檢測LDH的釋放也發(fā)現(xiàn)，H2O2處理引起的LDH過度釋放可被ATTM預(yù)處理明顯減輕。這至少說明ATTM可以保護細胞對抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞膜損害[14]。據(jù)文獻報道[15-16]，鉬(Mo)本身也具有調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化-還原狀態(tài)以及提高胰島素敏感性的作用，當(dāng)然，它的這些作用是否也參與了本研究中的抗皮膚氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)，以及ATTM長期應(yīng)用是否會對組織細胞造成損害，尚需要進一步的實驗支持。

總之，本研究率先報道了一傳統(tǒng)化合物ATTM具有釋放H2S的作用，這種化合物可以明顯減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚受損。作為未來H2S的另一個供體，從化學(xué)結(jié)構(gòu)分析其穩(wěn)定性要優(yōu)于S2-，且其釋放H2S的效率也不遜于GYY4137。當(dāng)然，關(guān)于此化合物是如何釋放H2S的，以及其是否還具有其它的細胞保護效應(yīng)和保護機制尚有待今后繼續(xù)研究。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

*[基金項目]山西省優(yōu)勢學(xué)科心血管生理和藥理學(xué)資助項目；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金資助項目(No. 03201310)

Identification of ATTM as a novel H2S donor and investigation of its protective effect on HaCaT skin cellsMENG Fu-hui1, CHEN Li1, XU Shi2, XIAN Ming2, ZHANG Hui1, LI Jian-hua1, DONG Qi1, YANG Chun-tao1

(1DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China;2DepartmentofChemistry,Wa-shingtonStateUniversity,WAPullman99164,USA.E-mail:yang-chuntao@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the ability of a metal complex ammonium tetrathiomolybdate (ATTM) to release H2S and its cytoprotective effect on an oxidative injury model. METHODS: Released H2S was absorbed in a reaction flask from ATTM dissolved in the cell medium. Staining with dichlorodihydrofluorescein diacetate or rhodamine 123 followed by photofluorography was conducted for the observation of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) levels, respectively. Cell viability and release of lactate dehydrogenase (LDH) from the cells were measured with commercial kits. RESULTS: Similar to another H2S donor GYY4137, ATTM had an ability to release H2S in the cell medium in a dose-dependent manner. Treatment of human skin HaCaT cells with ATTM at concentrations of 25～400 μmol/L didn’t significantly alter cell viability. Exposure of the cells to ultraviolet rays or a ROS donor H2O2increased the intracellular ROS levels. Treatment with 400 μmol/L H2O2significantly reduced the viability of HaCaT cells (P<0.01). However, before the treatment with H2O2, pretreatment with ATTM at 100 and 200 μmol/L markedly prevented the H2O2-induced cell injury (P<0.01). In addition, the treatment with H2O2triggered ΔΨmloss (P<0.01) and LDH release from the cells (P<0.01). Prior to suffering from H2O2injury, the preconditioning with 200 μmol/L ATTM significantly improved ΔΨmlevels (P<0.05) and attenuated LDH release from the cells (P<0.01).CONCLUSION: ATTM is capable of releasing H2S and protecting human skin cells against oxidative injury.

[KEY WORDS]HaCaT cells; Hydrogen sulfide; Ammonium tetrathiomolybdate; Oxidative stress

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[收稿日期]2015- 06- 16[修回日期] 2015- 09- 06

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2277- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.027

[中圖分類號]R962; R75; R363

[文獻標(biāo)志碼]A