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實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力模型構(gòu)建方法進(jìn)展①

許駿堯陳以狄程楊孫佳玥朱潔吳顥昕

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京210046)

重癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是在細(xì)胞免疫依賴性補(bǔ)體參與下，由乙酰膽堿受體抗體(Acetylcholine receptor antibody,AChR Ab)介導(dǎo)而產(chǎn)生的自身免疫系統(tǒng)疾病。位于神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)處的AChR是導(dǎo)致MG的自身免疫抗原。其發(fā)病原因及治療方法仍有待進(jìn)一步研究探討，所以研究實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力動(dòng)物模型(Experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)十分有必要。1973年P(guān)atrick等[1]首次從電鰻電器官提取純化AChR免疫家兔后建立了EAMG模型。隨著研究深入，越來越多建模方法被應(yīng)用到MG動(dòng)物模型上。本文對國內(nèi)外各種建模方法綜述如下。

1提純電鰩乙酰膽堿受體構(gòu)建EAMG模型

1.1經(jīng)典方法相比國外多從加利福尼亞電鰩電器官中提取AChR，在中國多選用較易獲得的國產(chǎn)電鰩。Wang等[2]利用親和層析技術(shù)從國產(chǎn)電鰩電器官中提純AChR蛋白后，與弗氏完全佐劑(CFA)混合成油包水乳劑，于第1、4周分別對Lewis大鼠足墊、腹部及背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，5周后大鼠開始出現(xiàn)漸進(jìn)性肌無力表現(xiàn)。

該方法證明外源性AChR(國產(chǎn)電鰩AChR)可成功誘導(dǎo)大鼠的MG，且在發(fā)病機(jī)制、癥狀、電生理及免疫學(xué)改變方面與人MG十分相似，適合MG具體發(fā)病機(jī)制、評估藥物有效性及治療機(jī)制等方面的研究。因其方法相對成熟，故利用該方法進(jìn)行后續(xù)研究的國內(nèi)外報(bào)道也最多，但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無法長期地穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體,故需多次用AChR免疫動(dòng)物，因而實(shí)驗(yàn)周期較長，不適合短期研究。

1.2利用人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建EAMG模型Lonberg等[3]在1994年建立了表達(dá)人免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)的轉(zhuǎn)基因小鼠，用不同免疫原接種此種小鼠后，均可產(chǎn)生針對該免疫原的人源性抗體。李紅花等[4]參照其方法成功構(gòu)建含有人Igμ、γ1和κ胚系基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并將由電鰩電器官提純的AChR與CFA一起于第0、3、5周皮下注射該小鼠。3周后小鼠出現(xiàn)肌無力癥狀并產(chǎn)生了人抗AChR抗體，且滴度與MG患者相似。由于采用了人Ig轉(zhuǎn)基因小鼠,其產(chǎn)生的抗體均為人源性抗體,這使得本法構(gòu)建的EAMG模型在免疫學(xué)上更接近人MG。本法目前屬于一種新的嘗試，國內(nèi)外文獻(xiàn)較少。

2被動(dòng)免疫法構(gòu)建EAMG模型

2.1用MG患者血清及血清內(nèi)成分建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型高波廷等[5]收集未使用過激素治療的AChR Ab陽性和陰性的MG患者血液，分離血清后以每次0.8 ml注射小鼠，連續(xù)7 d，并且為了避免小鼠對人血清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在初次注射血清后24 h再腹腔注射環(huán)磷酰胺300 mg/kg。兩組小鼠均出現(xiàn)肌無力癥狀及肌電圖衰減。此外，Burges等[6]將純化后的IgG制品注射小鼠，亦出現(xiàn)同樣的結(jié)果。

本方法證實(shí)MG是血清內(nèi)抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，同時(shí)提示血清陰性MG發(fā)病機(jī)制與血清陽性MG不完全相同，這為進(jìn)一步研究MG的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。因其造模周期相對較短，制備成本低，較主動(dòng)免疫也更便捷，故適合于如MG受體保護(hù)等短期研究。但因MG患者發(fā)病不穩(wěn)定，臨床常反復(fù)，且獲取未用激素治療過的MG患者血清較困難，以及不同患者具有異質(zhì)性的原因，模型結(jié)果的評定及實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化比較困難。

2.2通過MG患者胸腺組織移植建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型Sch?nbeck等[7]將MG患者的完整胸腺組織移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠腎被膜下，在小鼠血清中抗人AChR Ab可在1～2周后被檢測到，到11周時(shí)AChR Ab滴度可達(dá)到典型重度肌無力水平，且骨骼肌終板處可見到AChR Ab的沉積，而注射分離的胸腺細(xì)胞，僅能檢測到小鼠體內(nèi)抗AChR Ab的一過性增高。

該方法證實(shí)了AChR Ab的產(chǎn)生與維持和胸腺組織有關(guān)，而胸腺細(xì)胞雖然參與了發(fā)病過程，但并不是唯一的致病因素，這為MG患者胸腺致敏機(jī)制的研究打下了基石。

2.3通過移植MG患者外周淋巴細(xì)胞建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型Wang等[8]將MG患者血淋巴細(xì)胞分別腹腔注射嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠移植血淋巴細(xì)胞，或缺乏CD8+的淋巴細(xì)胞，或缺乏CD4+的淋巴細(xì)胞與MG患者抗AChR CD4+細(xì)胞構(gòu)成的重組細(xì)胞后，出現(xiàn)了MG樣癥狀。該方法證實(shí)了在MG的發(fā)病過程中CD4+細(xì)胞的必要性，屬于研究性模型。

2.4通過向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物腦室中注入MG患者AChR Ab建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型有研究表明，MG患者的病變部位不僅局限在NMJ處，還可以波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成中樞功能障礙[9]。

李柱一等[10]將收集的MG患者血清,用硫酸氨鹽析、ProteinG 和α-銀環(huán)蛇毒素-AChR(α-BGT-AChR)親和層析法提取AChR Ab后，將 AChR Ab注入大鼠側(cè)腦室,隔日重復(fù),共3次；2周后，大鼠除出現(xiàn)了與MG動(dòng)物模型十分相似的癥狀，還出現(xiàn)腦干聽覺傳導(dǎo)中樞功能障礙等癥狀。

該方法旨在研究腦脊液中AChR Ab引起MG中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的機(jī)制，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙與AChR Ab和神經(jīng)AChR結(jié)合有關(guān)，這與其他主動(dòng)、被動(dòng)免疫法誘導(dǎo)EAMG的機(jī)制不完全相同。中樞受損MG模型的建立將為進(jìn)一步闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元引起肌無力的機(jī)制提供依據(jù)。

2.5利用雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型mAb35雜交瘤細(xì)胞株是Lindstrom實(shí)驗(yàn)室制備于上世紀(jì)80年代左右的一系列AChR單克隆抗體之一，屬于IgG1,它可對多種品系A(chǔ)ChRα亞單位主要免疫區(qū)肽段產(chǎn)生直接反應(yīng)，同時(shí)其亦可與患者血清IgG競爭性結(jié)合小鼠AChR[11]。

在裸鼠腹腔內(nèi)注射經(jīng)挑選的處于對數(shù)生長期的mAb35雜交瘤細(xì)胞，一周后收集其腹水，采用硫酸銨鹽法提純IgG，透析后分裝保存。并用多聚甲醛固定后的TE671細(xì)胞與提純抗體進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。按0.25 mg/kg腹腔注射含已制備mAb35的生理鹽水1 ml；免疫后48 h內(nèi)動(dòng)物體重明顯減輕，肌力下降，活動(dòng)減少，血清中可檢測到AChR Ab；NMJ上AChR數(shù)量減少，突觸后膜褶皺減少間隙變大，符合MG特征性病理改變[12]。此外，也有成功利用mAb A7、mAb G10等誘導(dǎo)EAMG的報(bào)道[13,14]。

該方法鑒于血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移法存在具有異質(zhì)性的不足，旨在利用單克隆抗體建立較為標(biāo)準(zhǔn)化的EAMG模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，單克隆抗體可結(jié)合鼠AChR并成功誘導(dǎo)各項(xiàng)指標(biāo)與人MG十分相似的EAMG模型。其建模時(shí)間短，發(fā)病率高(達(dá)100%)而易于評估，且避免了異質(zhì)性，屬較標(biāo)準(zhǔn)化的被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型，國外多用此方法進(jìn)行短期研究。

2.6利用EAMG鼠AChR Ab建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型Lindstrom等[15]從EAMG大鼠血清中用40%(NH4)2SO4沉淀粗制Ig，并在DEAE柱上利用色譜法層析獲得IgG，注射前將抗體稀釋于生理鹽水中，注射到大鼠頸靜脈中。12 h后，大鼠即出現(xiàn)無力、疲勞等MG樣癥狀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)MG可通過血清中抗體轉(zhuǎn)移的方式在鼠之間轉(zhuǎn)移。該方法造模率高，肌無力維持時(shí)間短(72 h～7d)，適合短期復(fù)制模型，但由于需要已經(jīng)成功建模的EAMG鼠，故不適合首次實(shí)驗(yàn)。

3利用基因工程構(gòu)建EAMG模型

3.1重組人AChR建立EAMG模型Lennon等[16]將人工合成的人AChRα亞基1～210片段克隆入可誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，獲得了融合蛋白，并將其與等體積CFA制成乳劑，于大鼠肩背足墊等處多點(diǎn)注射，此外,每只大鼠均額外注射B.pertussis疫苗。大鼠于1個(gè)月后均出現(xiàn)了癥狀、血清抗體滴度、電生理學(xué)及生化指標(biāo)的MG樣改變。Sun等[17]從TE671細(xì)胞中獲取人AChRα亞基細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(Extracellular domain,ECD)序列,嵌入質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染BL21(DE3)plysS菌株，并用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)其表達(dá)，獲取并提純ECD蛋白，免疫大鼠，成功構(gòu)建EAMG。

該方法證實(shí)AChRα亞基1～210是ACh的結(jié)合位點(diǎn)和主要免疫區(qū)，其表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性，可成功誘導(dǎo)EAMG模型。相比經(jīng)典方法，本方法具有造模率較高，免疫原充足，操作簡便，成本低等優(yōu)點(diǎn)。

3.2采用核酸疫苗建立EAMG模型核酸疫苗通過將克隆靶抗原編碼的基因或DNA片段加入到如質(zhì)粒、噬菌體等載體中去，然后向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體內(nèi)注入重組后的載體，而使得機(jī)體表達(dá)靶抗原基因，從而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的體液和細(xì)胞免疫[18]。Niu等[19]將人AChRα亞基N端211個(gè)氨基酸(含ACh結(jié)合位點(diǎn)和主要免疫結(jié)構(gòu)域)基因片段插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.0中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA AChRα211；免疫前三天于小鼠左右股四頭肌注射0.5%布比卡因100 μl，免疫時(shí)在同部位注射含50 μg純質(zhì)粒DNA 100 μl,每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次，小鼠在免疫后均出現(xiàn)漸進(jìn)性肌無力的表現(xiàn)，ELISA檢測證實(shí)了特異性免疫的存在。孟和寶力高等[20]在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別重組大鼠白介素6(Interleukin-6,IL-6)和AChRα亞基N端205個(gè)氨基酸的質(zhì)粒，共同免疫大鼠,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，癥狀觀察、肌電圖、血清學(xué)檢測、組織學(xué)檢測等指標(biāo)均證實(shí),通過本方法建立MG模型是可行可靠的。

該方法利用近年來逐漸發(fā)展起來的新的免疫學(xué)技術(shù)——核酸疫苗，旨在構(gòu)建能在動(dòng)物體內(nèi)長期表達(dá)產(chǎn)生免疫原的EAMG模型。該核酸疫苗不但具有較好的免疫原性，且目的基因在體內(nèi)保留時(shí)間長，不斷表達(dá)抗原蛋白，產(chǎn)生較強(qiáng)的持久性免疫應(yīng)答[21]，對研究MG發(fā)病機(jī)理及治療手段具有實(shí)際意義。由于本法為新技術(shù)的探索性應(yīng)用，且上述研究也指出本法可能存在動(dòng)物模型癥狀較輕的情況，故目的基因的選取、表達(dá)情況及具體操作方法仍有待進(jìn)一步研究和完善。該方法屬于近幾年的新探索，具有廣闊的前景。

3.3利用轉(zhuǎn)基因小鼠NMJ局部產(chǎn)生的IFN-γ建立EAMG模型有研究表明：IFN-γ與重癥肌無力的發(fā)病十分密切[22]。Gu等[23]，將鼠IFN-γ基因與調(diào)節(jié)性片段——鼠nAChRε基因融合，構(gòu)建DNA質(zhì)粒，植入小鼠卵母細(xì)胞，使新生小鼠在神經(jīng)接頭處表達(dá)該基因并產(chǎn)生IFN-γ；結(jié)果顯示，約6個(gè)月后轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了肌無力癥狀、遲緩性麻痹和肌無力癥狀可被ACh酯酶抑制劑暫時(shí)性緩解等與人MG十分相似的特征，電生理學(xué)測試出現(xiàn)肌電圖振幅衰減陽性，組織學(xué)檢查顯示在終板處存在單核細(xì)胞浸潤和抗體的沉積；此外，免疫沉淀反應(yīng)分析也表明，轉(zhuǎn)基因小鼠血清中之前未知的87 kD靶抗原與大多數(shù)人MG血清中的相似。該方法證實(shí)MG的發(fā)病與IFN-γ有關(guān)。

4人工合成AChR多肽構(gòu)建EAMG模型

AChR由2個(gè)α、1個(gè)β、1個(gè)γ和1個(gè)δ共5個(gè)亞基組成。其中大部分肌無力動(dòng)物模型和MG患者中主要致病性抗體AChR Ab所攻擊的靶點(diǎn)位于α亞基內(nèi),其具有高度的免疫性，具有能引起MG的抗原決定簇，因此，特異性ACh反應(yīng)性T細(xì)胞可以通過刺激α亞基或α亞基的某些肽段的方式而被激活，從而產(chǎn)生機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]。

Lennon等[25]曾先后嘗試用人工合成的電鰻AChRα亞基125～147肽段(Tα125～147)和人AChRα亞基129-145肽段(Hα129-145)構(gòu)建EAMG,抗體陽性率從僅為10%提升至76%[26]。以上研究提示小分子肽可作為免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，構(gòu)建EAMG，且同源性與陽性率正相關(guān)。Baggi等[27]在此基礎(chǔ)上人工合成大鼠AChRα亞基97～116肽段(Rα97～116，不偶聯(lián)載體蛋白)與等量CFA充分混勻制成乳劑于大鼠手足墊多點(diǎn)注射，30 d后加強(qiáng)免疫一次。大鼠于加強(qiáng)免疫2周后出現(xiàn)進(jìn)行性肌無力，血清抗體陽性等，造模率達(dá)73.3%。國內(nèi)亦有利用Rα97-116、Tα125-147構(gòu)建EAMG的報(bào)道，造模率達(dá)75%以上[24,28]。

該方法證實(shí)人工合成的位于AChRα亞基的某些區(qū)段的同源肽段可作為免疫原誘導(dǎo)EAMG模型，為MG發(fā)病機(jī)制及治療研究提供了一種較為簡便的造模方法。其操作相對簡潔，陽性率高，成本較低，適合批量復(fù)制，是近年國內(nèi)外使用較多的方法。該模型的不足之處是：實(shí)驗(yàn)周期較長、因缺乏二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致抗原決定簇漂移、肌無力程度較輕、臨床積分低。

5針對人肌肉特異性激酶構(gòu)建EAMG模型

臨床上，大約有80%～90%的MG患者體內(nèi)存在AChR Ab，而在剩余的患者中有40%存在肌肉特異性激酶抗體(Muscle-spedfic kinase antibody,MuSK Ab)。MuSK是存在于肌細(xì)胞膜上的一種跨膜蛋白質(zhì)，對于AChR在突觸后膜上的聚集起關(guān)鍵作用，它的缺失同樣會阻礙神經(jīng)肌肉信號傳導(dǎo)，從而出現(xiàn)肌無力癥狀。

5.1主動(dòng)免疫法建立EAMG模型Punga等[29]將帶有His標(biāo)記的大鼠MuSK-ECD(aa21～491)序列的質(zhì)粒載體pCEP-PU轉(zhuǎn)染HEK 293 EBNA細(xì)胞。細(xì)胞上清通過Ni-NTA超流柱后透析純化，獲得大量高表達(dá)的蛋白。每只小鼠于手足墊、尾基部及背部多點(diǎn)注射與CFA充分混勻的含有10 μg MuSK蛋白的乳劑，28 d后重復(fù)注射一次。小鼠于4周后開始出現(xiàn)MG樣癥狀、突觸后膜的改變、體重減輕，且呈進(jìn)行性加重。

5.2被動(dòng)轉(zhuǎn)移法建立EAMG模型Cole等[30]將MuSK陽性患者血清IgG過濾消毒后，每日于小鼠腹腔注射45 mg，連續(xù)5 d以上，首次注射后24 h，需另注射環(huán)磷酰胺300 mg/kg。類似的，Klooster等[31]每日腹腔注射4 mg提純的IgG4，7 d后小鼠出現(xiàn)體重下降、漸進(jìn)性肌無力及肌電圖衰減等。

由于MuSK Ab介導(dǎo)的MG的具體機(jī)制目前仍尚未明確，動(dòng)物模型均處于研究階段，且相比臨床發(fā)病率更高的抗AChR MG，本類研究起步晚，也相對較少，研究水平尚待提高。不過，近幾年對其機(jī)制的研究正逐漸成為MG研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

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[收稿2015-03-06修回2015-04-09]

(編輯倪鵬)

中圖分類號R332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0428-04

作者簡介：許駿堯(1993年-)，男，主要從事自身免疫系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)方面研究，E-mail:296428835@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：吳顥昕(1965年-)男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管病及自身免疫系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床方面研究，E-mail:wuhaoxin@souhu.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.030

①本文為2014年江蘇省大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃省級重點(diǎn)項(xiàng)目(201410315003Z)。