劉　炬，　楊　瀟，　岳　媛，　王樂旬，　吳鐘凱

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心外二科，廣東 廣州 510080)

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▲并列第1作者

PI3K/AKT信號通路在SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化過程中的影響*

劉炬▲，楊瀟▲，岳媛，王樂旬，吳鐘凱△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心外二科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 進一步確定日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑(SjCystatin)誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化的亞型及相關(guān)機制。方法: 用ELISA、RT-qPCR或Western blot法測定IL-10、IL-12、巨噬細胞亞型表面標(biāo)志物L(fēng)IGHT(M2b)及Arg-1(M2a+M2c)的表達；用Western blot法測定AKT的磷酸化水平。結(jié)果: SjCystatin處理組在6 h、12 h和24 h時IL-10表達量持續(xù)增加；處理12 h， LIGHT的mRNA和蛋白表達量增加但Arg-1的mRNA和蛋白表達量降低；AKT磷酸化水平增加。PI3K/AKT抑制劑處理組IL-10的釋放量在12 h和24 h持續(xù)降低；24 h， LIGHT的mRNA和蛋白表達量降低但Arg-1的mRNA和蛋白表達量增加；AKT的磷酸化水平減少。結(jié)論: SjCystatin 促進了活化的M2巨噬細胞分化為M2b亞型巨噬細胞，并且PI3K/AKT信號通路參與了這一過程。

[關(guān)鍵詞]半胱氨酸蛋白酶抑制劑； M2b巨噬細胞； M2巨噬細胞； PI3K/AKT信號通路

巨噬細胞極化(macrophage polarization)/分化是單核巨噬細胞系統(tǒng)的重要特點，根據(jù)其分化后誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的類型不同，可將分化后的巨噬細胞分為M1和M2型巨噬細胞[1]。M2型巨噬細胞又可根據(jù)其表面分子標(biāo)志物和功能進一步分為M2a、M2b和M2c[2]3種，它們在炎癥調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。

眾所周知，寄生蟲體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，巨噬細胞是它們眾多靶向細胞中的一員[3]。研究表明cystatin具有良好的抗炎作用[4]。本實驗中所應(yīng)用的cystatin蛋白——SjCystatin為通過體外重組表達的日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)分子[5]。

已有研究表明cystatin對巨噬細胞有誘導(dǎo)分化作用，并且經(jīng)cystatin誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的巨噬細胞是M2型巨噬細胞，后者產(chǎn)生了大量的IL-10，可有效緩解急性炎癥的反應(yīng)程度[4]。我們的前期實驗研究也證實參與炎癥反應(yīng)的巨噬細胞在受到SjCystatin誘導(dǎo)后可以分化成為M2巨噬細胞，且伴有大量的IL-10生成，但是經(jīng)SjCystatin誘導(dǎo)后M2巨噬細胞分化為何種亞型及相關(guān)機制尚不明確[5]。本研究我們將嘗試進一步闡明M2巨噬細胞分化的亞型及它們之間的相互作用機制。

材料和方法

1巨噬細胞細胞來源和SjCystatin獲取、鑒定

SjCystatin的獲取、鑒定和前期實驗方法相同[5]。RAW264.7 巨噬細胞選自于中山大學(xué)寄生蟲研究室。

2主要試劑

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS;E.coliO55:B5)購于Sigma；澳洲胎牛血清和高糖DMEM選購于Gibco；PI3K/AKT抑制劑LY294002購于Cell Signaling Technologies；IL-10和IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒選購于Bioscience; CCK-8試劑盒購于上海優(yōu)選生物科技有限公司； RT-qPCR試劑盒購于TaKaRa；免疫印跡試劑盒等選購于碧云天生物技術(shù)研究所。

3方法

3.1細胞培養(yǎng)和活力測試將RAW264.7細胞飼養(yǎng)在含10%胎牛血清和DMEM的25 mm2塑料培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。采用CCK-8法測定細胞存活率。將RAW264.7細胞接種于96孔板中，接種密度為5×105/cm2，然后用SjCystatin(2.5 mmol/L)和PI3K/AKT抑制劑LY294002共同孵育24 h。每孔中加入20 μL CCK-8(10%)孵育1 h后，收集上清液，并在450 nm處用酶標(biāo)儀測量吸光度(A)，評價細胞存活率。

3.2細胞培養(yǎng)、分組、干預(yù)和收集將RAW264.7細胞飼養(yǎng)在含10%胎牛血清和DMEM的25 mm2塑料培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h 后棄培養(yǎng)基,將細胞分為4組(對照組、LPS組、LPS+SjCystatin組和LPS+SjCystatin+LY294002組)，接種于6孔板中，接種密度為5×105/cm2，分別向無血清培養(yǎng)基中加入10 mg/L SjCystatin、1 mg/L LPS和(或)10 μmol/L PI3K/AKT抑制劑LY294002,繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)4 h、6 h、12 h和24 h刺激后分別收取細胞和上清。

3.3ELISA測定上清細胞因子的含量分別參照小鼠ELISA試劑盒操作說明書步驟處理標(biāo)本，在酶標(biāo)儀中450 nm處測量A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到各吸光度所對應(yīng)的上清中IL-10和IL-12的含量。

3.4提取RNA和雙雜交探針實時熒光定量PCR法檢測細胞表面標(biāo)志物的表達量應(yīng)用TRIzol RNA提取液后，按照氯仿-異丙醇法提取細胞總RNA后根據(jù)TaKaRa染料法實時熒光定量試劑盒說明書操作步驟進行雙雜交探針實時熒光定量PCR。PCR在Roche Cycler 480系統(tǒng)進行。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s(45個循環(huán))。引物序列見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

F: forward; R: reverse.

3.5裂解巨噬細胞和Western blot法檢測p-AKT的蛋白水平按照細胞全蛋白抽提試劑盒說明書提取細胞總蛋白。冰PBS清洗2次，棄去PBS，按照說明加入蛋白裂解液。冰浴條件下進行勻漿，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，去除沉淀，留取上清。按照蛋白定量測試盒說明書測定各組蛋白濃度制備5%濃縮膠和10%分離膠，每孔上樣量為70 μg，進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜并加入I抗，4 ℃過夜，次日PBST洗膜5 min 4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG II抗，按1∶5 000稀釋，室溫孵育1～2 h，PBST洗膜5 min 5次。ECL顯色，膠片掃描后用Quantity One軟件分析灰度值，并計算比值后比較差異性。

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化為M2b亞型巨噬細胞

1.1SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化后細胞因子含量的變化如圖1所示， SjCystatin處理組的IL-10的含量隨時間變化持續(xù)上升，并在24-h達到高峰，和LPS處理組相比較，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；和LPS處理組相比較，SjCystatin處理組中IL-12/IL-10比值在所有時間點均偏小，并且在6 h時最小，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。

Figure 1.The release of IL-10 (A) and the ratio of IL-12/IL-10 (B) in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

圖1SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后IL-10含量的變化

1.2SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化后細胞表面標(biāo)志物及細胞因子mRNA表達量的變化由圖2可見，在SjCystatin作用下，RT-qPCR結(jié)果顯示IL-10、IL-12的mRNA表達量隨時間變化有增加趨勢，但IL-12的mRNA表達量均小于同時點IL-10的mRNA表達量；經(jīng)過12 h刺激后，和LPS處理組相比較，SjCystatin處理組中LIGHT的mRNA表達量增加明顯(P<0.05)；SjCystatin處理組中Arg-1的mRNA表達量在12 h時較LPS處理組減少(P<0.05)，但在24 h時Sjcystatin處理組中Arg-1的mRNA表達量較LPS處理組明顯增加(P<0.01)，但表達量仍小于同時點LIGHT的mRNA表達量。

Figure 2.The mRNA expression in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsLPS.

圖2SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后mRNA表達量的變化

由圖3、4可見，在12 h時，和LPS處理組相比，SjCystatin處理組LIGHT蛋白水平明顯增加(P<0.05),而Arg-1蛋白水平卻明顯減少(P<0.05)。

Figure 3.The effect of SjCystatin on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of LIGHT. After treatment with LPS and SjCystatin for 12 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

圖3SjCystatin誘導(dǎo)M2亞型巨噬細胞極化后LIGHT蛋白水平的變化

Figure 4.The effect of SjCystatin on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of Arg-1. After treatment with LPS and SjCystatin for 12 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Wes-tern blot assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

圖4SjCystatin 誘導(dǎo)M2亞型巨噬細胞極化后Arg-1蛋白水平的變化

1.3SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化后AKT磷酸化水平的變化Western blot實驗結(jié)果顯示，LPS處理組有少量p-AKT，經(jīng)過SjCystatin刺激后，其蛋白水平較LPS處理組明顯增加，且兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein level of p-AKT in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

圖5SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后p-AKT水平的變化

2PI3K/AKT 信號通路對 SjCystatin誘導(dǎo)的M2巨噬細胞中細胞因子表達量的影響

2.1PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)的M2巨噬細胞中細胞因子含量的影響如圖6所示，SjCystatin處理組的RAW264.7 巨噬細胞經(jīng)PI3K/AKT 信號通路抑制劑 LY294002干預(yù)后，其IL-10含量在12 h和24 h均較干預(yù)前下降。

Figure 6.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the release of IL-10 in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin. Mean±SD.n=4.

圖6PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后IL-10含量的影響

2.2PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)的M2巨噬細胞中細胞表面標(biāo)志物和細胞因子mRNA表達量的變化PCR實驗結(jié)果顯示，SjCystatin處理組的RAW264.7 巨噬細胞經(jīng)PI3K/AKT 信號通路抑制劑 LY294002干預(yù)后，IL-10的mRNA表達量在12 h和24 h均較干預(yù)前略有下降，但差異不顯著；在抑制劑干預(yù)后12 h和24 h，和SjCystatin處理組相比較，干預(yù)組LIGHT的mRNA表達量均呈下降趨勢，且24 h最為明顯(P<0.05)； 而干預(yù)組Arg-1的mRNA表達量則在24 h明顯增加(P<0.05)。

Figure 7.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the expression of mRNA.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS+SjCystatin.

圖7PI3K/AKT信號通路抑制劑對SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后mRNA表達量的影響

由圖8、9可見，在24 h 時，和LPS+SjCystatin處理組相比，LPS+SjCystatin+LY294002處理組LIGHT蛋白水平明顯減少(P<0.05),而Arg-1蛋白水平雖略有增加，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 8.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of LIGHT. After treatment with LPS and SjCystatin for 24 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS+SjCystatin.

圖8PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后LIGHT蛋白水平的影響

Figure 9.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of Arg-1. After treatment with LPS and SjCystatin for 24 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot.Mean±SD.n=4.

圖9PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后Arg-1蛋白水平的影響

2.3PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)的M2巨噬細胞中AKT磷酸化水平的變化如前所述，將SjCystatin 及PI3K/AKT 信號通路抑制劑 LY294002同時加入細胞無血清培養(yǎng)基1 h后觀察AKT的磷酸化情況。Western blot實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過LY294002干預(yù)后，AKT的磷酸化水平與干預(yù)前比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖10。

Figure 10.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the expression of p-AKT in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.

圖10PI3K/AKT 信號通路抑制劑對 SjCystatin誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化后p-AKT蛋白水平的影響

討論

巨噬細胞作為一種具有可塑性和多功能性的細胞群體，在不同的生理和疾病狀態(tài)中可以表現(xiàn)出不同的表型[6]。不同表型各自擁有獨特特征和功能，例如M2a和M2c亞型巨噬細胞擁有參與其代謝過程的重要蛋白Arg-1[7]，而M2b亞型巨噬細胞受到LPS刺激后可以表達出高水平的LIGHT蛋白，且能分泌大量的白介素10和少量的白介素12[8]，而其余亞型巨噬細胞則沒有這個生物學(xué)特點，因此高表達IL-10和低表達IL-12也被認(rèn)為是廣義的 M2b亞群巨噬細胞的表型標(biāo)志[7，9]。隨著對免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)了M2亞型巨噬細胞在治療炎癥性疾病和自身免疫性疾病中的獨特作用。Cystatin作為寄生蟲產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子，通過誘導(dǎo)M2巨噬細胞分化為M2b亞型巨噬細胞，從而分泌大量的具有抑炎作用的IL-10，在治療一些炎癥性疾病和自身免疫性疾病方面顯示了不錯的效果[10]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)SjCystatin誘導(dǎo)活化的巨噬細胞使得6 h IL-12/IL-10比值明顯減少且能夠分泌大量具有抑炎作用的IL-10， 并能高表達M2b亞型巨噬細胞表面標(biāo)志物L(fēng)IGHT的mRNA和蛋白水平，提示著SjCystatin誘導(dǎo)活化的巨噬細胞分化為了M2b亞型巨噬細胞。在12 h M2a和M2c亞型巨噬細胞表面標(biāo)志物Arg-1的mRNA和蛋白水平表達量的降低也側(cè)面證實了SjCystatin誘導(dǎo)活化的巨噬細胞分化為了M2b亞型巨噬細胞，而不是M2a和M2c亞型巨噬細胞。在24 h Arg-1表達量的增多預(yù)示著M2a和M2c亞型巨噬細胞的增多，可能的原因是M2b亞型巨噬細胞分泌的大量IL-10刺激了M2a和M2c亞型巨噬細胞數(shù)目的增加，既往實驗報道可以解釋這種現(xiàn)象[2]。

PI3K/AKT 是公認(rèn)的細胞內(nèi)經(jīng)典的重要信號途徑，其具有多種細胞調(diào)節(jié)功能[11-12]。Hofmann[13]等報道PI3K/AKT信號通路的激活與抑炎介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，巨噬細胞的極化也依賴于PI3K/AKT信號通路途徑[14]。在本實驗中，我們觀察到活化的巨噬細胞在受到SjCystatin干預(yù)后，巨噬細胞內(nèi)的p-AKT蛋白水平明顯增加，說明受到干預(yù)的巨噬細胞在極化為M2b亞型巨噬細胞的過程中，伴隨有AKT的活化，這證實了SjCystatin可能通過PI3K/AKT信號通路途徑誘導(dǎo)了巨噬細胞的分化。在另一組實驗中，在加入了PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002后我們可以觀察到IL-10含量減少，24 h M2b亞型巨噬細胞表面標(biāo)志物L(fēng)IGHT的mRNA和蛋白水平表達量明顯下降，巨噬細胞內(nèi)的p-AKT蛋白水平增加量降低，提示著PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002的加入降低了SjCystatin誘導(dǎo)活化的巨噬細胞極化為M2b亞型巨噬細胞的效率，側(cè)面證實了M2b亞型巨噬細胞的產(chǎn)生依賴于PI3K/AKT信號通路途徑。由此可推斷，PI3K/Akt信號通路途徑在SjCystatin誘導(dǎo)活化的巨噬細胞極化為M2b亞型巨噬細胞過程中起著重要作用。

本實驗證實活化的巨噬細胞在體外實驗中被SjCystatin誘導(dǎo)分化為M2b亞型巨噬細胞，并且PI3K/AKT信號通路途徑在此過程中起著重要作用。本實驗研究讓我們對寄生蟲SjCystatin免疫調(diào)節(jié)分子與巨噬細胞之間的關(guān)系有了更好的理解，也為進一步研究M2b巨噬細胞在免疫調(diào)控和炎癥調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用增添了一份參考。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of PI3K/AKT signaling pathway on polarization of M2 macrophages induced by SjCystatin

LIU Ju, YANG Xiao, YUE Yuan, WANG Le-xun, WU Zhong-kai

(DepartmentofCardiacSurgeryII,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:wuzhk@mail.sysu.edu.cn)

[KEY WORDS]Cystatin; M2b macrophages; M2 macrophages; PI3K/AKT signaling pathway

[ABSTRACT]AIM: To investigate the subtype of M2 macrophages induced bySchistosomajaponicumcystatin (SjCystatin) and to determine the mechanism underlying these effects.METHODS: The releases of IL-10 and IL-12, and the expression of macrophage subtype markers LIGHT (M2b) and Arg-1 (M2a+M2c) were assessed by ELISA, RT-qPCR and Western blot. The phosphorylation level of AKT was assessed by Western blot.RESULTS: SjCystatin promoted the continuous increase in IL-10 level at 6 h, 12 h and 24 h, and increased the amount of mRNA and protein expression of LIGHT, but down-regulated the amount of mRNA and protein expression of AKT. The addition of PI3K/AKT inhibitor reduced the release of IL-10 at 12 h and 24 h, reduced the mRNA and protein expression of LIGHT at 24 h, up-regulated the mRNA and protein expression of Arg-1 at 24 h, and decreased the phosphorylation level of AKT.CONCLUSION: SjCystatin promotes the differentiation of M2 macrophage to M2b macrophage subtype, and the PI3K/AKT signaling pathway is involved in this process.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 0971- 07

[收稿日期]2016- 03- 21[修回日期] 2016- 05- 11

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81570039)； 廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. S2013040012612)

通訊作者△Tel: 020-87755766-8816； E-mail: wuzhk@mail.sysu.edu.cn

[中圖分類號]R392.21; R363

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.002