張明石　李曉飛　李明軍　畢　勝　王德超

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江　佳木斯　154002)

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自發(fā)性高血壓大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)與Th17細胞的相關(guān)性

張明石李曉飛李明軍畢勝1王德超2

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江佳木斯154002)

目的探討自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腦出血后炎癥反應(yīng)與Th17細胞的相關(guān)性。方法SHR隨機分為正常對照組，假手術(shù)組和模型組各5只。膠原酶大腦尾狀核注射制備大鼠自發(fā)性高血壓腦出血(HICH)模型。出血后48 h，冰上取腦。流式細胞儀檢測腦組織中Th17細胞占CD4+T細胞的百分比；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測腦組織上清中白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。結(jié)果與正常對照組和假手術(shù)組相比，模型組腦組織中Th17細胞數(shù)量明顯增加，同時IL-6和TNF-α分泌水平明顯升高。結(jié)論腦出血急性期炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和發(fā)生與Th17細胞的參與密切相關(guān)，Th17細胞促進了腦出血后的病理進程；可能部分通過誘導(dǎo)炎性細胞因子IL-6和TNF-α分泌增加實現(xiàn)的。

自發(fā)性高血壓；腦出血；炎癥反應(yīng)；Th17

在世界范圍內(nèi)，腦卒中是一組發(fā)病率、致殘率和死亡率均很高的疾病，而高血壓腦出血(HICH)的病死率和致殘率則居各型腦卒中之首〔1〕，30 d病死率高達38%～52%。腦出血誘發(fā)的腦損傷中，四分之一屬于炎性反應(yīng)及補體系統(tǒng)參與的免疫損傷〔2〕。炎癥反應(yīng)(炎性細胞和炎癥介質(zhì))與繼發(fā)性腦組織損害密切相關(guān)。Th17細胞是新發(fā)現(xiàn)的與 Th1、Th2細胞完全不同的CD4+T細胞系，具有獨立的分化和調(diào)節(jié)機制〔3〕。Th17可分泌白細胞介素(IL)-17、IL-21和 IL-22等，在促炎反應(yīng)和自身免疫病中發(fā)揮重要作用。本文觀察高血壓大鼠腦出血后Th17細胞數(shù)量變化特點，直觀反映Th17在HICH腦損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料健康自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，體重250～300 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物中心提供(合格證：SCKX(京)2002-0003)。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組各5只。主要試劑有抗CD3-PE單抗、抗CD4-FITC單抗(GK1.5克隆)、抗IL-17A-APC單抗和抗FcγⅢ/Ⅱ受體抗體(2.4G2克隆)：BD Pharmigen公司(美國)；抗IL-17A mAb：Biolegend公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒：R&D 公司(美國)(MN)；IL-6 ELISA試劑盒：R&D 公司(美國)(MN)；Ⅶ型膠原酶：Sigma公司(美國)。主要儀器有流式細胞儀，BD Aria，美國；酶標(biāo)檢測儀，MoH 99-15，芬蘭LM。

1.2模型制作參照徐雅〔4〕的方法：麻醉大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/kg)，將大鼠固定于腦立體定位儀并且暴露顱骨〔5〕，鉆開顱骨，將0.5 μl膠原酶(含有膠原酶0.5 mg)通過微量注射器垂直注入大鼠腦組織尾狀核部位。觀察5 min后取出微量注射器縫合。正常組無任何操作，假手術(shù)組以等體積的生理鹽水進行尾狀核注射。

1.3動物處理大鼠出血48 h后斷頸，取出全部腦組織并迅速切取尾狀核注射針孔前后2 mm腦組織，全部操作需冰上進行。一部分加入適量的3%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)迅速制備單細胞懸液，用于流式檢測；另一部分加入預(yù)冷生理鹽水(0.25 ml/100 mg腦重)迅速勻漿，低溫14 000 r/min，離心15 min。取上清-80℃保存，用于細胞因子檢測。

1.4流式細胞儀檢測CD3+CD4+IL-17+T細胞數(shù)量制備腦細胞懸液，CD3-FITC、CD4-PE和IL-17A-APC 三色同時標(biāo)記，設(shè)陰性對照管。取新鮮制備的1×106個腦單細胞懸液加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體預(yù)處理的流式專用管，隨后加入FITC-抗CD3和PE-抗CD4熒光抗體表面染色，3%胎牛血清(FCS)洗2次，加入固定透膜劑孵育30 min，再加入APC-抗IL-17A 熒光抗體細胞內(nèi)染色。同時同型對照抗體(FITC)大鼠IgG2b染色。應(yīng)用FACSCELLQUEST 軟件，記錄Th17占CD4+T細胞的百分率。

1.5細胞因子檢測檢測血清中IL-6和TNF-α水平變化，并計算細胞因子含量?？蛇x用雙抗體夾心ELISA試劑盒，檢測結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制，應(yīng)用Soft Max Pro 4.3.1LS軟件分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1腦出血48 h后腦組織中Th17細胞數(shù)量的變化與正常對照組(0.37%±0.24%)相比，模型組腦組織中CD3+CD4+IL-17+T細胞數(shù)量(3.83%±0.43%)明顯增加(P<0.01)；與假手術(shù)組(0.71%±0.37%)相比也明顯增加(P<0.01)。

2.2腦出血48 h后腦組織中IL-6水平的變化與正常對照組〔(3.71±0.38)pg/ml〕相比，假手術(shù)組〔(6.37±0.65)pg/ml〕和模型組腦組織中IL-6水平〔(13.16±0.78)pg/ml〕均明顯升高(P<0.01)；與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中IL-6水平也明顯升高(P<0.01)。

2.3腦出血48 h后腦組織中TNF-α水平的變化與正常對照組〔(3.77±0.39)pg/ml〕相比，模型組腦組織中TNF-α水平〔(7.81±0.85)pg/ml〕明顯升高(P<0.01)；與假手術(shù)組〔(4.01±1.00)pg/ml〕相比，模型組腦組織TNF-α水平也明顯升高(P<0.05)。

3　討　論

炎癥是一種常見的病理現(xiàn)象，腦出血后血腫及其血腫本身的機械壓迫是引發(fā)周圍組織炎性反應(yīng)的重要因素。然而炎癥反應(yīng)又是引發(fā)繼發(fā)性腦損傷的必要條件〔2〕。炎性反應(yīng)一方面可以幫助宿主清除和吸收壞死組織和細胞碎片，修復(fù)損傷，是機體正常防御性反應(yīng)。但其也有不利的一面，即炎性反應(yīng)過程中會導(dǎo)致多種酶/炎癥介質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)腦組織周圍水腫及神經(jīng)細胞損傷加重〔6〕。

多位學(xué)者研究證實，HICH后在血腫內(nèi)及血腫周圍有炎癥反應(yīng)發(fā)生，白細胞的浸潤和小膠質(zhì)細胞的活化誘導(dǎo)了IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的釋放，并在48 h達高峰，且能持續(xù)1 w〔7〕。IL-6的主要細胞來源包括T、B淋巴細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞，對于腦組織，星形細胞和小膠質(zhì)細胞則是IL-6的主要來源，參與HICH后的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)并發(fā)揮重要作用，是腦損傷程度及預(yù)后的重要監(jiān)測指標(biāo)〔8〕。TNF是促炎性細胞因子，單核-巨噬細胞是TNF-α的主要來源。神經(jīng)細胞、星形細胞和小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TNF-α的主要來源，其主要生物學(xué)功能包括殺傷腫瘤，調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答。

Th17 細胞是有別于Th1 和Th2 細胞的一種新的CD4+T細胞亞群。Th17分泌的細胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-6和TNF-α等細胞因子，因此Th17細胞被認(rèn)為是一群介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細胞〔9〕。對于Th17細胞的作用機制，通常認(rèn)為它可以通過誘導(dǎo)其他炎癥細胞因子如IL-6，TNF-α及趨化因子如單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-2等的表達，介導(dǎo)炎癥細胞到達病變局部，造成組織損傷〔10〕。本研究提示，Th17細胞參與了腦出血急性期炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和發(fā)生，促進了腦出血后的病理進程。可能部分通過誘導(dǎo)炎性細胞因子IL-6和TNF-α分泌增加實現(xiàn)的。但Th17細胞在腦出血發(fā)病中的作用機制尚需進一步研究。

1中華神經(jīng)科學(xué)會.各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，1996；291(6)：379-82.

2Gong C，Hoff JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Brain Res，2000；871(1)：57-65.

3Littman DR，Rudensky AY.Th17 and regulatory T cell in mediating andrestraining inflammation〔J〕.Cell，2010；140(6)：845-58.

4徐雅.安工清開靈干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型炎癥反應(yīng)的機制研究〔D〕.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

5Arvin B，Neville LF，Barone FC，etal.Brain injury and inflammation：a putative role of TNF alpha〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995；765：62-71.

6Del Zoppo GJ，Becker KJ，Hallenbeck JM.Inflammation after stroke〔J〕.Arch Neurol，2001；58(4)：669-72.

7張祥建，李春巖，劉春燕，等.炎癥反應(yīng)與大鼠腦出血后腦損傷的相關(guān)性〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2005；38(6)：396-7.

8Fassbender K，Rossol S，Kammer T，etal.Proinflammtory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemia：kinetics of serection and relation to the extent of brain damage and outcome of disease〔J〕.J Neurol Sci，1994；122(2)：135-9.

9Nurieva R，Yang XO，Martinez G，etal.Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells〔J〕.Nature，2007；448：480-3.

10Kolls JK，Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation〔J〕.Immunity，2004；21：467-76.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

黑龍江省自然科學(xué)基金(No.B2015013)

畢勝(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)免疫學(xué)研究。

張明石(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科學(xué)研究。

R743.34

A

1005-9202(2016)17-4146-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.004

1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院