基于指紋圖譜技術(shù)的銀杏葉黃酮類(lèi)成分分析研究進(jìn)展

閆玉嬌， 吳佩穎

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

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基于指紋圖譜技術(shù)的銀杏葉黃酮類(lèi)成分分析研究進(jìn)展

閆玉嬌， 吳佩穎

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

摘要：以銀杏葉為原料的制劑被廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病，其主要有效物質(zhì)為黃酮類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)成分。目前，指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量的分析評(píng)價(jià)已得到廣泛認(rèn)可。本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)基于該技術(shù)的銀杏葉黃酮類(lèi)成分研究進(jìn)展進(jìn)行歸納綜述。

關(guān)鍵詞：銀杏葉；黃酮類(lèi)成分；指紋圖譜技術(shù)

銀杏GinKgo biloba L.為銀杏科植物，現(xiàn)僅存1屬1種，是新生代第四紀(jì)冰川時(shí)期孑遺植物，素有“活化石”之稱(chēng)［1］。銀杏葉（GinKgo Folium）是其干燥葉，作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其藥用功效在我國(guó)中醫(yī)論著《滇南本草》、《本草綱目》、《本草品匯精要》中均有記載［2］。繼《中國(guó)藥典》1977年版收載了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，2005年版增加了銀杏葉提取物和銀杏葉片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2010年版新增了銀杏葉膠囊和銀杏葉滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2015年版則未作增加。此外，《歐洲藥典》規(guī)定了銀杏葉和銀杏葉提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《美國(guó)藥典》將銀杏葉及其制劑作為食品補(bǔ)充劑收錄在冊(cè)。銀杏葉及其制劑是全球植物藥制劑的重要品種之一，在治療心腦血管疾病方面發(fā)揮著重要作用［3］。

銀杏葉中的主要成分有黃酮、萜內(nèi)酯、有機(jī)酸、氨基酸、聚戊烯醇、糖、礦物質(zhì)、色素、生物堿等，其中有效成分為黃酮和萜內(nèi)酯。本文主要對(duì)基于指紋圖譜技術(shù)的銀杏葉黃酮類(lèi)成分研究進(jìn)展進(jìn)行歸納綜述。

1 銀杏葉黃酮類(lèi)成分及其藥理作用

銀杏葉中的黃酮類(lèi)化合物多以苷的形式存在，其苷元主要包括黃酮、黃酮醇、雙黃酮、黃烷醇、異黃酮、二氫黃酮幾類(lèi)［4］。

1.1 黃酮（醇）苷類(lèi) 主要以槲皮素、山柰素、異鼠李素為苷元，以葡萄糖基、鼠李糖基、香豆?；鶠檠苌鶊F(tuán)連接而成（如蘆丁）。此外，還有少量以楊梅素、落葉松黃酮、丁香亭、芹黃素為苷元苷類(lèi)［5］。

1.2 黃酮醇類(lèi) 即C環(huán)3位被-OH取代，主要有槲皮素、山柰素、異鼠李素、楊梅素、落葉松黃酮、丁香亭、檉柳黃素。

1.3 黃酮類(lèi) 即C環(huán)3位未被-OH取代，而且C2-C3鍵為不飽和結(jié)構(gòu)，主要有芹黃素、木犀草素、金合歡素。

1.4 異黃酮類(lèi) 即B環(huán)與C環(huán)3位相連的結(jié)構(gòu)，主要有染料木素。

1.5 雙黃酮類(lèi) 即由二分子黃酮衍生物聚合而成的二聚物，多由二分子芹菜素（或其甲醚衍生物）構(gòu)成，雙黃酮是裸子植物的特征性成分，主要有穗花杉雙黃酮、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金錢(qián)松雙黃酮、5' -甲氧基去甲銀杏雙黃酮［6］。

1.6 二氫黃酮類(lèi) 即C環(huán)3位未被-OH取代，而且C2-C3鍵為飽和結(jié)構(gòu)，此類(lèi)化合物較少，現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的有aromadendrin和5，7，4'-trihydroxy-flavone［7］。

1.7 黃烷醇類(lèi) 即C環(huán)3位被-OH取代，而且C2-C3鍵為飽和結(jié)構(gòu)，主要有兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸兒茶素和表沒(méi)食子酸兒茶素。此外，還有以分子聚合形式生成的原花青素類(lèi)，含有量較高，但目前只分得單體原花青定和原翠雀素［8］。

1.8 藥理作用 銀杏葉黃酮及其苷類(lèi)成分具有很強(qiáng)的抗自由基和抗氧化作用［9］，可延緩疲勞發(fā)生［10］，而且還有抗癌［11］、抗菌［12］、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗血栓［13］和抗糖尿病并發(fā)癥等藥理活性，可預(yù)防心腦血管疾病（如動(dòng)脈粥樣硬化［14］），提升記憶力，預(yù)防老年癡呆癥。臨床上多用于動(dòng)脈硬化及高血壓所致的冠狀動(dòng)脈供血不全、心絞痛、心肌梗塞、腦栓塞、腦血管痙攣等心腦血管疾病的治療。此外，銀杏雙黃酮可通過(guò)抗磷酸二酯酶活性而達(dá)到有效減肥的目的［15］。

2 基于指紋圖譜技術(shù)的銀杏葉黃酮類(lèi)成分分析研究

銀杏葉中黃酮類(lèi)成分復(fù)雜，各成分含有量和極性差異大，故其質(zhì)量控制具有一定困難。為克服現(xiàn)有質(zhì)量控制模式的局限性，采用指紋圖譜技術(shù)可有效解決銀杏葉中黃酮類(lèi)成分復(fù)雜、難以分析的問(wèn)題，已成為研究的熱點(diǎn)。

2.1 中藥指紋圖譜研究與應(yīng)用的基本狀況 目前，指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制方法之一，已被國(guó)內(nèi)外藥學(xué)領(lǐng)域所認(rèn)可。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）將中藥材及中藥注射劑的指紋圖譜定義為“中藥材或中藥注射劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)識(shí)該中藥材或該中藥注射劑特性的共有峰的圖譜成為指紋圖譜［16］”；美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）允許草藥保健品申報(bào)指紋圖譜；英國(guó)草藥典、印度草藥典及加拿大藥用級(jí)芳香植物學(xué)會(huì)、德國(guó)藥用植物學(xué)會(huì)接受指紋圖譜；歐盟、歐共體也將色譜指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)用于植物藥的質(zhì)量控制［17］；世界衛(wèi)生組織（WHO）在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則也認(rèn)為，可提供色譜指紋圖譜來(lái)證明產(chǎn)品質(zhì)量一致；日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)自1980年以來(lái)，已在企業(yè)內(nèi)部采用HPLC指紋圖譜控制質(zhì)量。

我國(guó)對(duì)中藥指紋圖譜的研究最早可追溯到20世紀(jì)60年代，其包括中藥材、提取物、中藥飲片和中成藥等，根據(jù)分析手段不同，可分為中藥生物指紋圖譜和中藥化學(xué)指紋圖譜。其中，前者主要有DNA指紋圖譜，Mei等［18］以ISSR和RADD分析方法為基礎(chǔ)，建立銀杏DNA指紋圖譜，生成銀杏遺傳特征地圖，為該植物的遺傳特征描述提供方法；后者主要有色譜指紋圖譜（薄層色譜、高效液相、氣相液相、高速逆流色譜、高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜）、光譜指紋圖譜（紫外光譜，紅外光譜，核磁共振氫譜、X-射線衍射指紋圖譜［19］）以及采用多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用所得到的多維多息特征譜（HPLC-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS［20］）等。目前針對(duì)銀杏葉，大多采用色譜指紋圖譜。

2.2 銀杏葉黃酮類(lèi)成分的分析研究

2.2.1 高效液相（HPLC）指紋圖譜 HPLC具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高、選擇性高的特點(diǎn)，而且隨著檢測(cè)器種類(lèi)（如UV、DAD、ELSD）的增加，其適用范圍越來(lái)越廣，已成為應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法。

李奕雅［21］以銀杏葉對(duì)照提取物為參照，制定銀杏干葉指紋圖譜，獲得共有峰11個(gè)。吳靜等［22］以水-乙腈-異丙醇-檸檬酸為流動(dòng)相，建立銀杏葉提取物指紋圖譜，獲得共有峰14個(gè)。牟玲麗［23］以蘆丁為參照物，制定了銀杏提取物對(duì)照?qǐng)D譜，標(biāo)定共有峰16個(gè)，為進(jìn)一步分析血清圖譜中藥源性來(lái)源奠定了基礎(chǔ)。楊興變等［24］在360 nm波長(zhǎng)下分析銀杏葉和針劑用銀杏葉提取物，得到共有峰18個(gè)。丁銀花等［25］以氯仿回流提取除雜，甲醇提取有效成分，制定銀杏葉指紋圖譜，得到共有峰28個(gè)。趙一懿等［26］以銀杏葉對(duì)照藥材為參照，制定銀杏葉藥材指紋圖譜，獲得共有峰24個(gè)，并同時(shí)兼顧11個(gè)黃酮類(lèi)成分的定量測(cè)定。Xie等［27］在254 nm和360 nm波長(zhǎng)下建立銀杏葉提取物指紋圖譜，通過(guò)對(duì)19批樣品相似度的比較和聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜可用于揭示中藥摻假摻雜現(xiàn)象。陳偉等［28］分別制定了銀杏達(dá)莫注射液原料、中間體和成分的指紋圖譜，并指認(rèn)其中7個(gè)主要色譜峰，用于生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制。孫冬梅［29］以蘆丁和異鼠李素為參照物，制定銀杏葉藥材指紋圖譜，獲得共有峰30個(gè)。Ji等［30］在350 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下建立銀杏葉提取物指紋圖譜，得到共有峰30個(gè)，同時(shí)闡明建立指紋圖譜的相關(guān)研究思路。李利鋒等［31］利用2.7 μm粒徑填料C18色譜柱來(lái)優(yōu)化色譜條件，建立銀杏葉片HPLC定量指紋圖譜，得到共有峰48個(gè)，同時(shí)進(jìn)行4個(gè)成分的含有量測(cè)定。

此外，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）作為通用型檢測(cè)器，可補(bǔ)充沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)。崔紅芳［32］制定了銀杏藥材HPLC-ELSD指紋圖譜，以白果內(nèi)酯為參照物，獲得共有峰18個(gè)。除了單一檢測(cè)器的應(yīng)用外，多種檢測(cè)器聯(lián)用模式也得到了發(fā)展，可同時(shí)兼顧黃酮類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)成分的檢測(cè)。陳凡［33］利用HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用技術(shù)制定了銀杏葉提取物多維指紋圖譜，其中DAD檢測(cè)器取360 nm下圖譜，獲得共有峰19個(gè)；ELSD檢測(cè)器獲得共有峰14個(gè)。Van Nederkassel等［34］利用HPLC-UV-ELSD技術(shù)建立銀杏提取物指紋圖譜，其中UV檢測(cè)器取267 nm下圖譜，獲得色譜峰77個(gè)，而ELSD檢測(cè)器獲得色譜峰73個(gè)。

2.2.2 液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）指紋圖譜 由于中藥的復(fù)雜性，單一分析方法難以全面提供其所需信息，而聯(lián)用技術(shù)不僅可使復(fù)雜成分得到有效分析，還可提供化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)信息，是分析復(fù)雜成分的有效手段。

馬欣［35］運(yùn)用API-ES離子源負(fù)離子檢測(cè)銀杏提取物的乙醇提取液，成功得到質(zhì)譜總離子流圖51個(gè)共有峰，比HPLC色譜圖（33個(gè)）更全面。孫冬梅等［36］以負(fù)離子模式建立銀杏磷脂軟膠囊中12種黃酮類(lèi)成分的快速篩查方法，為保健食品質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。梁文琳［37］制定銀杏葉片甲醇溶液指紋圖譜，HPLC色譜圖得到共有峰31個(gè)，同時(shí)運(yùn)用Q-TOF-MS技術(shù)鑒定出31個(gè)共有峰均為黃酮類(lèi)成分。Liu等［38］以UHPLC-QQQ-MS技術(shù)對(duì)銀杏葉片黃酮苷、黃酮苷元和內(nèi)酯類(lèi)成分共18個(gè)化合物同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定。Zhou等［39］利用UAE-UHPLC-TQ/MS2技術(shù)建立銀杏葉26種成分的同時(shí)定性定量方法，實(shí)現(xiàn)黃酮、內(nèi)酯、酚酸和苯丙素類(lèi)4種類(lèi)型化合物的同時(shí)檢測(cè)。Guo等［40］將二維UHPLC （LC×LC）技術(shù)用于銀杏葉提取物分析，并結(jié)合DPPH法篩選具有清除自由基活性的成分，結(jié)果在鑒定出的61種化合物中得到25種活性成分；Ding等［41］以capillary HPLC/ MS方法建立銀杏葉指紋圖譜，定性分析77個(gè)化合物，進(jìn)一步闡明銀杏葉活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2.3 加壓毛細(xì)管電色譜法/毛細(xì)管電泳（pCEC/CE）指紋圖譜 毛細(xì)管電泳（CE）具有高效、抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)，而毛細(xì)管電色譜（CEC）是液相色譜（LC）和毛細(xì)管電泳的結(jié)合，既解決了后者選擇性差的問(wèn)題，又提高了前者的分離效率。加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）是將高壓泵和進(jìn)樣閥引入到毛細(xì)管電色譜中，進(jìn)一步拓展其優(yōu)勢(shì)［42］。吳孔弦［19］利用TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀分析了銀杏葉藥材加壓毛細(xì)管電色譜指紋圖譜，得到29個(gè)共有峰。馬欣［35］利用毛細(xì)管電泳技術(shù)分析了銀杏葉提取物指紋圖譜，得到13個(gè)共有峰。

2.2.4 薄層色譜（TLC）指紋圖譜 薄層色譜具有分析速度快、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)、結(jié)果直觀形象、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，但由于分辨率較低，在復(fù)雜成分的指紋圖譜應(yīng)用中受到局限。楊錦瑜等［43］利用薄層色譜紫外分析儀制定了銀杏葉薄層指紋圖譜，以蘆丁、槲皮素為參照物，獲得黃酮斑點(diǎn)12個(gè)。楊天鳴等［44］對(duì)7個(gè)不同廠家的銀杏葉片進(jìn)行分析，獲得X-射線衍射Fourier指紋圖譜。孫國(guó)祥等［45］利用傅里葉紅外分光光度儀制定了銀杏葉片紅外指紋圖譜?？紫轾i等［46］利用傅里葉變換紅外光譜儀制定了銀杏葉化學(xué)組分群動(dòng)態(tài)指紋圖譜。張小利等［47］對(duì)不同工藝制備銀杏葉提取物進(jìn)行譜圖特征分析。劉建莊［15］利用核磁共振技術(shù)，對(duì)用以銀杏葉提取物為原料經(jīng)酸水解后的產(chǎn)物進(jìn)行了一系列指紋圖譜分析。牟新利等［48］用三維熒光來(lái)研究銀杏葉中藥指紋圖譜。

3 小結(jié)

基于指紋圖譜技術(shù)對(duì)銀杏葉黃酮類(lèi)成分的研究作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效手段時(shí)，不僅可真實(shí)反映藥材、中間體、中成藥的內(nèi)在質(zhì)量，還可通過(guò)三者相關(guān)性分析來(lái)達(dá)到追溯作用，為合理采收提供依據(jù)［49］，也為原料藥產(chǎn)地固定提供理論支持［25］。此外，指紋圖譜技術(shù)可用于控制整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈實(shí)時(shí)監(jiān)控［24］、對(duì)照物質(zhì)標(biāo)定［50］，也可用于聯(lián)合用藥后的安全性考察。何正有等［51］建立指紋圖譜來(lái)考察銀杏達(dá)莫注射液與7個(gè)藥物的配伍穩(wěn)定性，為臨床用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。

隨著分析儀器水平的不斷提高，高效液相指紋圖譜正逐漸替代薄層色譜指紋圖譜，成為主要分析手段。質(zhì)譜的應(yīng)用也使指紋圖譜越來(lái)越要求盡可能闡明色譜峰成分，由“宏觀”向“微觀”延伸，不僅要求整體的“相似度”，而且可精確分辨“非相似”部分的成分。因此，獲得更全面的色譜信息和更精確的成分鑒定是使指紋圖譜進(jìn)一步完善的重要部分。

當(dāng)然，指紋圖譜技術(shù)仍存在如下問(wèn)題：（1）中藥指紋圖譜質(zhì)量控制方法若以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為參考，則由于實(shí)驗(yàn)條件一致性而無(wú)法確定是否可能影響重復(fù)性；若以對(duì)照品為參考，則存在品種覆蓋不全面等問(wèn)題；（2）銀杏葉是天然產(chǎn)物，所含黃酮類(lèi)成分的內(nèi)在不穩(wěn)定性及外在條件差異，使其穩(wěn)定性難以掌控；（3）指紋圖譜研究?jī)H專(zhuān)注于共有峰，著力于模式識(shí)別和相似性判斷，而忽略指紋峰的鑒定以及特定提取部位的生物效應(yīng)表征，容易在樣品處理過(guò)程中丟失相關(guān)藥效的成分，使標(biāo)準(zhǔn)圖譜缺乏可靠性［52］；（4）指紋圖譜研究應(yīng)進(jìn)行更深層次的研究，探討化學(xué)成分指紋圖譜-藥效指紋圖譜-藥物代謝指紋圖譜的關(guān)系，建立三維模式［53］。只有更加深入地開(kāi)展研究，更好地解決指紋圖譜技術(shù)對(duì)銀杏葉黃酮類(lèi)成分研究中存在的問(wèn)題，才能在生產(chǎn)實(shí)際中得到推廣應(yīng)用，有效保證銀杏葉原料、提取物、制劑的質(zhì)量，真正實(shí)現(xiàn)藥品安全、有效、穩(wěn)定的目標(biāo)。

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*通信作者：吳佩穎（1961—），男，教授，博士生導(dǎo)師，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幹扑幮录夹g(shù)及其產(chǎn)業(yè)化。E-mail：wupeiyingsh @163.com

作者簡(jiǎn)介：閆玉嬌（1989—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幹扑幮录夹g(shù)及其產(chǎn)業(yè)化。E-mail：smile_ as_ yun@126.com

收稿日期：2015-12-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.033

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1123-05