信吉閣，曾養(yǎng)志

(1. 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 65020；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

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靶向基因修飾技術(shù)在免疫缺陷動(dòng)物模型研究中的應(yīng)用進(jìn)展

信吉閣1,2，曾養(yǎng)志1*

(1. 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 65020；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

免疫缺陷動(dòng)物模型在人類相關(guān)疾病機(jī)理研究、藥物研發(fā)、器官移植研究和干細(xì)胞研究中有重要的應(yīng)用。但由于傳統(tǒng)基因修飾動(dòng)物構(gòu)建技術(shù)難度大、效率低等限制，在中型、大型動(dòng)物中獲得的免疫缺陷動(dòng)物模型還很少。近年來(lái)新興的靶向基因修飾技術(shù)，包括ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等，為高效率免疫缺陷動(dòng)物模型構(gòu)建提供了技術(shù)基礎(chǔ)。本文就ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9的技術(shù)原理及研究進(jìn)展進(jìn)行概況介紹，并詳細(xì)地闡述這些技術(shù)在中型和大型動(dòng)物中免疫缺陷動(dòng)物模型構(gòu)建方面取得的進(jìn)展，包括KORag1/Rag2兔、KORag1/Rag2豬、KOIL2rg豬、KOPpar-/Rag1猴等。這些免疫缺陷動(dòng)物模型不僅能用于人類SCID相關(guān)疾病研究，評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植的效率和安全性，且可進(jìn)行臨床前手術(shù)治療研究，生產(chǎn)人源化動(dòng)物模型等，進(jìn)而架起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與醫(yī)學(xué)應(yīng)用的橋梁，促進(jìn)臨床前細(xì)胞再生策略的綜合評(píng)價(jià)體系的發(fā)展。

免疫缺陷；動(dòng)物模型；靶向基因修飾技術(shù)；Rag基因；IL2rg基因

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物模型常被稱為人類替難者，科研活試劑，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的與人類相關(guān)的基礎(chǔ)研究，已在醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域做出了許多創(chuàng)造性、里程碑式的科研成果。而免疫缺陷動(dòng)物是指由于先天性遺傳突變或人工方法造成免疫系統(tǒng)某種或多種成分缺陷的動(dòng)物，是一種進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。從先天性無(wú)胸腺的裸鼠(nude mouse)、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥(severe combined immunodeficient disease，SCID)小鼠的發(fā)現(xiàn)，到移植了人免疫組織或免疫細(xì)胞使之具有人類部分免疫系統(tǒng)的SCID-hu小鼠，利用這些免疫缺陷動(dòng)物模型，已在細(xì)胞水平和分子水平闡明了造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)生和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵問(wèn)題，而且在病毒學(xué)、免疫學(xué)、血液病學(xué)等研究領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。此外還在犬[1, 2]、豬[3, 4]、馬[2, 5]等大型哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的先天性自發(fā)的免疫缺陷動(dòng)物。但先天性的免疫缺陷動(dòng)物數(shù)量和類型少，且不能人為控制。

轉(zhuǎn)基因修飾技術(shù)和體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)的發(fā)展和完善，為生產(chǎn)免疫缺陷動(dòng)物模型的構(gòu)建開(kāi)辟了嶄新的途徑。常用的基因修飾技術(shù)有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、原核顯微注射、精子載體法、SCNT及胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)法等。每種方法都存在一定的優(yōu)劣勢(shì)。其中原核顯微注射技術(shù)被認(rèn)為是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最可靠的方法，特別是在小鼠中，這一技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，但易產(chǎn)生嵌合體，且需要在獲得大量的動(dòng)物個(gè)體基礎(chǔ)上再進(jìn)行轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)的篩選。盡管基于完善的ES系統(tǒng)和胚胎重建技術(shù)，小鼠基因敲除操作技術(shù)得以較廣泛地應(yīng)用。如已獲得多種與免疫缺陷相關(guān)的基因修飾鼠[6-9]。但大多數(shù)動(dòng)物尚未建立完善的ES系統(tǒng)，科學(xué)研究者在大動(dòng)物ES建系方面雖然做了很多努力，但都沒(méi)有能夠得到生殖系嵌合ES。由于缺少真正的ES，大動(dòng)物的基因打靶難以實(shí)現(xiàn)，利用傳統(tǒng)方法獲得基因敲除動(dòng)物的報(bào)道很少。

1 新興的靶向基因敲除技術(shù)

近年來(lái)新興了多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)，包括鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nucleases，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)及CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9)技術(shù)等。這些技術(shù)提高了基因敲除的效率和特異性，不僅為研究基因功能開(kāi)辟了新的途徑，也能有助于大動(dòng)物免疫缺陷模型構(gòu)建研究，進(jìn)而促進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究的發(fā)展。

1.1 ZFNs

ZFNs技術(shù)的核心設(shè)計(jì)原則是將特異性識(shí)別模塊和功能模塊這兩種有特定功能的結(jié)構(gòu)域融合，形成具有特定功能的蛋白[10]。3-6個(gè)Cys2-His2鋅指蛋白重復(fù)單位構(gòu)成單個(gè)ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其功能是特異性識(shí)別1個(gè)三聯(lián)體堿基；FokI的C端的96個(gè)氨基酸殘基組成單個(gè)ZFN的DNA剪切域，具有非特異性核酸內(nèi)切酶功能。一個(gè)鋅指蛋白組與一個(gè)FokI單體相連組成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的基因靶位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)靶位距離為6-8 bp時(shí)，兩個(gè)單體ZFN相互作用而產(chǎn)生酶切功能[11]。在這特異位點(diǎn)產(chǎn)生1個(gè)DNA雙鏈切口(double strand breaks，DSB)，然后利用細(xì)胞固有的(homologous recombination，HR)或非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)這兩種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)。HR途徑可使基因組DNA得到完全的修復(fù)，或是在DSB位置發(fā)生基因交換，而NHEJ途徑可基因組DNA會(huì)產(chǎn)生插入堿基或者缺失堿基，可能會(huì)產(chǎn)生移碼突變，進(jìn)而導(dǎo)致基因功能喪失[12, 13]。

利用ZFNs技術(shù)在特定基因位點(diǎn)產(chǎn)生的DSB，研究者近年來(lái)已經(jīng)在植物、線蟲(chóng)、果蠅、兩棲類、人體細(xì)胞等多物種中進(jìn)行高效率的基因定點(diǎn)修飾[14]。2009年ZFNs在嚙齒類哺乳動(dòng)物中應(yīng)用成功，獲得了基因打靶大鼠[15]。2011年Lai等[16]首次采用這一技術(shù)成功獲得PPAR-γ基因打靶豬，這是世界上首次采用該技術(shù)在大型哺乳動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的定點(diǎn)修飾，為缺少有效ES細(xì)胞的大動(dòng)物的基因打靶提供了高效的技術(shù)路線。

1.2 TALENs技術(shù)

研究在植物細(xì)菌Xanthomonassp中發(fā)現(xiàn)了TAL蛋白氨基酸序列與核苷酸序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即其核酸結(jié)合域的氨基酸序列和其靶位點(diǎn)的核苷酸序列的確定關(guān)系，NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、HD識(shí)別C、NN識(shí)別G。重復(fù)單元由34個(gè)氨基酸重復(fù)序列組成，其被稱為重復(fù)可變雙殘基(repeat variable di-residue，RVD)的第12和13個(gè)氨基酸能對(duì)應(yīng)識(shí)別特定堿基[17, 18]。利用TAL蛋白的特性，組成能特異結(jié)合堿基序列的模塊蛋白，可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因修飾。利用TAL的序列模塊，可構(gòu)建識(shí)別任意靶序列的重組核酸酶，如研究者將TALEs蛋白C末端的AD替換為FokI限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建了具有較高效率的人工核酸酶TALENs[19]，實(shí)現(xiàn)在特異的位點(diǎn)切斷靶基因，然后在該位點(diǎn)進(jìn)行敲入，敲除或點(diǎn)突變操作。

TALENs與ZENs效率相似，但在基因序列選擇，細(xì)胞、物種選擇上具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)TALENs實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)步驟更簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)所需成本低，脫靶現(xiàn)象少而產(chǎn)生的毒性低。TALENs技術(shù)可在植物、人類細(xì)胞、酵母、斑馬魚(yú)以及大、小鼠、爪蟾，家蠶等各物種上進(jìn)行基因修飾操作[20]。Carlson等[21]利用構(gòu)建的TALENs，在牛和豬上采用胚胎顯微注射和篩選細(xì)胞克隆的方法嘗試獲得基因敲除家畜，成功地得到了Ldlr基因敲除豬。Lai等[22]采用體外轉(zhuǎn)錄TALENs mRNA向兔受精卵胞質(zhì)內(nèi)注射的方法，獲得Rag1和Rag2基因敲除兔。Liu等[23]利用TALENs技術(shù)在恒河猴和獼猴上實(shí)現(xiàn)了基因敲除。TALENs基因打靶技術(shù)的研究和應(yīng)用為高效率的基因打靶提供了技術(shù)基礎(chǔ)，將推動(dòng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展。

1.3 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas是研究者基于細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)改造而建立起來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌被外來(lái)的噬菌體或病毒入侵時(shí)，能通過(guò)CRISPR，即被稱為成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，或是與之相關(guān)Cas的序列在RNA的介導(dǎo)下剪切外來(lái)基因，達(dá)到抵御的作用[24]。研究人員設(shè)計(jì)單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA，sgRNA)，能模擬crRNA和tracrRNA的結(jié)構(gòu)特征且具備了crRNA-tracrRNA復(fù)合物的功能，即在sgRNA-Cas系統(tǒng)中sgRNA部分能與Cas9結(jié)合并定向識(shí)別DNA序列，而Cas9則具有核酸內(nèi)切酶的活性[25]。

與ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)相比較，CRISPR/Cas特點(diǎn)是制作過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、效率高[26]。Wang等[27]研究者用CRISPR/Cas9系統(tǒng)一步法獲得了多基因突變的小鼠。利用CRISPR/Cas9已獲得多種基因打靶動(dòng)物，如大鼠[28]、小鼠[29]、豬[30]、猴[31]等。Whitworth等[32]報(bào)道通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得CD163和CD1D基因敲除體細(xì)胞，然后進(jìn)行SCNT獲得了基因敲除豬。2014年10月Zou和本文作者等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和改造后的Cas9-nickase系統(tǒng)，選擇PARK2和PINK1及編碼酪氨酸酶的TYR基因，進(jìn)行基因敲除操作，通過(guò)對(duì)PFFs轉(zhuǎn)染一對(duì)gRNA質(zhì)粒和Cas9n質(zhì)粒成功獲得20頭PARK2和PINK1雙基因敲除和15頭具有典型白化表型特征的TYR基因敲除豬模型[33]。

作為一個(gè)新興的技術(shù)，CRISPR/Cas9目前存在最大的爭(zhēng)議就是脫靶問(wèn)題，相比于ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)，因識(shí)別的靶位點(diǎn)序列短，CRISPR/Cas9系統(tǒng)似乎更容易出現(xiàn)脫靶問(wèn)題。多項(xiàng)研究通過(guò)提高CRISPR/Cas9的特異性以減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生[34,35]。

2 新技術(shù)在免疫缺陷動(dòng)物模型構(gòu)建上的應(yīng)用

ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9技術(shù)等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)，已在多種動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)了基因修飾模型的構(gòu)建，這里主要介紹在中型和大動(dòng)物上已獲得的與免疫缺陷相關(guān)的動(dòng)物模型。這些工作主要集中在是對(duì)重排激活基因(recombination activating gene，Rag)基因和白介素2受體基因(interleukin-2 receptor gamma，IL2rg，或cCD132)基因敲除研究。RAG基因主要是負(fù)責(zé)T細(xì)胞和B細(xì)胞重排的重組激活基因，RAG1/2基因編碼酶，能催化Ig和TCR基因V(D)J重排，在B和T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生多樣性的B和T細(xì)胞初級(jí)免疫。Rag1/2基因是兩個(gè)相鄰的基因，位于常染色體，編碼的酶是蛋白復(fù)合體協(xié)同地行使功能。兩個(gè)基因中的任意一個(gè)打斷，V(D)J重排不能完成，B和T細(xì)胞的發(fā)育停滯在不成熟階段。Rag1/2基因功能在不同的哺乳動(dòng)物物種里是保守的。在人類中，Rag1/2突變導(dǎo)致B和T細(xì)胞完全缺失，稱為Omenn，不正常的T細(xì)胞沒(méi)有足夠的重排，能引起自體反應(yīng)，病人癥狀與移植物抗宿主疾病相似。Rag1/2敲除小鼠免疫缺陷，特征是缺少成熟B、T細(xì)胞[6, 7]。IL2rg基因突變會(huì)嚴(yán)重阻礙B細(xì)胞，T細(xì)胞的發(fā)育和功能，完全阻礙了NK的發(fā)育，影響了淋巴結(jié)間葉原基的發(fā)育，繼而淋巴結(jié)發(fā)育和組織不完全。哺乳動(dòng)物IL2rg同源基因特異地位于X染色體，人類IL2rg突變將導(dǎo)致X染色體連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency，XSCID)。T細(xì)胞、NK細(xì)胞缺失或數(shù)量極度減少，但B細(xì)胞數(shù)量上正常(或是增加)但功能喪失。IL2rg基因突變已發(fā)展了許多不同免疫缺陷小鼠品系[8]。

現(xiàn)對(duì)在兔、豬、猴這些中大型動(dòng)物上已獲得的免疫缺陷模型及相關(guān)研究進(jìn)展簡(jiǎn)要介紹如下。

2.1 免疫缺陷兔模型

兔是一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)其某些遺傳性狀進(jìn)行定向修飾，可大大地拓展家兔在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。但是，由于世界上還沒(méi)有建立起具有生殖系嵌合能力的家兔胚胎干細(xì)胞系，兔的克隆效率又極低，獲得基因敲除兔的難度極大。Song等[22]首次將TALENs技術(shù)應(yīng)用于兔基因敲除研究，根據(jù)TALENs靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，分別在Rag1和Rag2上設(shè)計(jì)一對(duì)TALENs，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行胞質(zhì)注射，移植受體后分別獲得了18和15個(gè)仔兔，突變率分別高達(dá)94.4%和93.3%，其中，Rag1有11只(61.1%)仔兔發(fā)生雙敲，Rag2有7只(46.7%)仔兔產(chǎn)生雙敲。該研究獲得了世界首例免疫缺陷家兔疾病模型，并建立了兔基因打靶的高效技術(shù)平臺(tái)。

兔是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與小鼠相比，其生理結(jié)構(gòu)、發(fā)病癥狀等都更接近于人類。且體型適中，適合進(jìn)行反復(fù)活體監(jiān)測(cè)、采樣等操作；同時(shí)繁殖快、飼養(yǎng)成本低適合大樣品量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集。而且一些致病突變?cè)谕蒙弦鸬陌Y狀和在人類上引起的癥狀非常相似。誘發(fā)和自發(fā)突變的兔品種構(gòu)建多種疾病模型，包括動(dòng)脈粥樣硬化、肥厚性心肌疾病、糖尿病等[39, 40]。該研究獲得的Rag基因敲除兔細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育停滯，喪失了絕大部分的免疫功能等表型，將為生物醫(yī)學(xué)研究包括人類相關(guān)疾病(如Omenn綜合征)發(fā)病機(jī)制、藥物開(kāi)發(fā)、器官移植研究和干細(xì)胞研究提供了重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

2.2 免疫缺陷豬模型

Huang等[36]分別針對(duì)豬的Rag1和Rag2的外顯子設(shè)計(jì)了TALENs質(zhì)粒對(duì)，對(duì)豬的胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后獲得雜合和純合的Rag1/2敲除的細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆用于體細(xì)胞核移植后獲得27頭克隆豬，其中有10頭為Rag2單等位堿基缺失，9頭為Rag1雙等位堿基缺失，3頭為Rag2雙等位堿基缺失，這些堿基缺失都導(dǎo)致了外顯子讀碼框移碼。Rag1/2雙等位敲除豬表現(xiàn)出了典型的SCID特征，包括胸腺萎縮，脾臟發(fā)育不良，淋巴細(xì)胞減少，體細(xì)胞基因組V(D)J重排消失，無(wú)成熟的T、B細(xì)胞。由于豬在體型、壽命、生理指標(biāo)，特別是免疫機(jī)制等與人類相近，該研究成功建立的Rag敲除的SCID小型豬模型有望在生物醫(yī)藥和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。

Lee等[37]進(jìn)行了移植人iPS細(xì)胞和同種異體豬細(xì)胞到Rag2基因敲除重癥聯(lián)合免疫缺陷豬的研究。利用TALENs系統(tǒng)，SCNT獲得了Rag2基因敲除豬。雙敲的豬或是缺失胸腺，或是發(fā)育不全。B、T細(xì)胞脾臟白髓缺失。在普通的飼養(yǎng)環(huán)境，在四周時(shí)與年齡相當(dāng)野生型豬相比，Rag2基因敲除豬表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，脾臟有炎癥和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。飼養(yǎng)在干凈的環(huán)境里會(huì)更健康，注射人的iPS細(xì)胞，很快形成畸胎瘤，具有3胚層。進(jìn)行同種異體滋養(yǎng)層干細(xì)胞移植有耐受性。

Masaito等[38]研究者采用了一種操作簡(jiǎn)單且無(wú)外源基因整合的策略獲得了IL2rg基因敲除豬，利用ZFN-編碼mRNA轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，獲得基因敲除細(xì)胞后進(jìn)行SCNT，共出生4頭雄性IL2rg基因敲除豬。表型分析發(fā)現(xiàn)基因敲除豬完全缺失胸腺，T細(xì)胞，NK細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到，B細(xì)胞數(shù)量正常，這些與人類X-連鎖SCID疾病相似。

Shunichi等[41]利用同源重組和連續(xù)核移植的方法也獲得了雜合子IL2rg+/-雌性豬和IL2rg基因敲除雌性豬和IL2rg-/Y的雄性豬，表型為無(wú)胸腺，免疫球蛋白顯著受損，T細(xì)胞，NK細(xì)胞明顯減少，與人類SCID癥狀相似。同種異體骨髓移植，供體細(xì)胞在IL2rg-/Y雜合子中穩(wěn)定整合。

因豬生理學(xué)與人類更接近，與嚙齒類模型相比，豬動(dòng)物模型能高保真地復(fù)制一些人類疾病，尤其對(duì)一些免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病。SCID豬模型能為再生醫(yī)學(xué)研究、異種器官移植、腫瘤發(fā)育提供有效的模型，有助于發(fā)展人類SCID疾病治療策略，在移植生物學(xué)中也將有廣泛的應(yīng)用。

2.3 RAG1基因敲除猴

2014年2月Niu等[31]研究者首次獲得了靶向基因編輯猴。猴是重要的動(dòng)物模型，猴疾病模型能更好地模擬人類疾病，降低藥物研究的風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)發(fā)有效的治療方案等。該研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，經(jīng)胚胎細(xì)胞注射方法，同時(shí)對(duì)調(diào)節(jié)代謝的基因Ppar-γ，調(diào)節(jié)免疫功能的基因Rag1，調(diào)節(jié)干細(xì)胞和性別決定的基因這三個(gè)基因進(jìn)行敲除，在對(duì)15個(gè)胚胎的基因組DNA 進(jìn)行測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)其中有8個(gè)胚胎顯示出兩個(gè)靶基Ppar-γ和Rag1同時(shí)突變。隨后，將基因修飾過(guò)胚胎移植到代孕母猴體內(nèi)，生出了一對(duì)孿生猴。檢測(cè)這對(duì)孿生猴的基因組DNA證實(shí)的確存在Ppar-γ和Rag1基因突變。研究人員指出，嬰兒猴目前仍太小，尚不能斷定基因編輯是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生生理和行為學(xué)影響。3年后猴成年時(shí)，還需觀察這些基因編輯對(duì)后代是否有影響。該研究首次成功獲得了基因工程靈長(zhǎng)類，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在猴基因敲除研究的有效性。

3 應(yīng)用前景

干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上有廣泛應(yīng)用前景，現(xiàn)已獲得的人iPSCs，可能為個(gè)體移植治療提供組織來(lái)源。但仍需考慮的問(wèn)題是獲得的iPS是否有潛在全能性，應(yīng)用于移植治療是否安全。因此研究者越來(lái)越認(rèn)識(shí)到除了嚙齒類，在許多生物醫(yī)藥應(yīng)用上需要建立更多其他動(dòng)物模型[42, 43]，用于器官和細(xì)胞移植方案的研究。而且，嚙齒類小鼠和人類免疫系統(tǒng)功能和調(diào)節(jié)的各方面都有顯著的不同[44]，不適用于模擬一些人類遺傳疾病和感染疾病，且對(duì)于外科手術(shù)和臨床監(jiān)測(cè)操作來(lái)說(shuō)，嚙齒類體型過(guò)小[45]。研究者試圖通過(guò)非人靈長(zhǎng)類來(lái)彌合嚙齒類和人類之間的空白。但存在苛刻的倫理道德限制，在歐洲禁止使用黑猩猩用于生物醫(yī)學(xué)研究，美國(guó)NIH也在2011年下令停止黑猩猩用于開(kāi)展新的研究。綜合考慮豬是理想的免疫缺陷動(dòng)物模型。在Lee等[37]研究中發(fā)現(xiàn)Rag2敲除豬和Rag2敲除鼠在表型上存在明顯不同，敲除鼠有小的但可檢測(cè)到的胸腺[7]，而豬則為完全沒(méi)有胸腺或完全沒(méi)有發(fā)育。在IL2rg基因敲除豬中也有相似的發(fā)現(xiàn)[38, 41]。IL2rg基因打靶小鼠盡管表現(xiàn)出免疫缺陷表型[46]，包括NK細(xì)胞活性消失，注射純化的人類造血干細(xì)胞，可重構(gòu)有功能的人類造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。但人的XSCID與IL2rg敲除小鼠存在表型上區(qū)別，IL2rg敲除小鼠B細(xì)胞減少，IL2rg敲除豬有B細(xì)胞，與人類XSCID表型更接近。利用新技術(shù)高效獲得帶有T-B-NK+SCID表型的Rag2突變豬，T-B+NK-IL2rg基因敲除豬，能作為人類SCID相關(guān)疾病的模型，評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植的效率和安全性，進(jìn)行臨床前手術(shù)治療研究，生產(chǎn)人源化豬。

近年來(lái)新興的靶向基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，新技術(shù)突破了傳統(tǒng)技術(shù)的低效性，且特異性極高，極大地促進(jìn)了動(dòng)物模型構(gòu)建研究的發(fā)展，已在多個(gè)物種上成功實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾[47]。同時(shí)通過(guò)對(duì)小鼠等模式動(dòng)物的基礎(chǔ)研究，現(xiàn)在對(duì)多種嚴(yán)重的人類疾病的分子基礎(chǔ)已經(jīng)了解清楚，再利用近年來(lái)新興的靶向基因敲除技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在兔、豬、猴等動(dòng)物上復(fù)制遺傳疾病候選基因的損傷。大動(dòng)物在基礎(chǔ)研究方面不太可能代替小鼠，但已經(jīng)為平移研究提供強(qiáng)大的補(bǔ)充資源，架起實(shí)驗(yàn)室研究與醫(yī)學(xué)應(yīng)用的橋梁。當(dāng)然，建立新的動(dòng)物品系需要進(jìn)行詳細(xì)深入的特征描述，充分地在動(dòng)物上模擬人類疾病特征。在中型和大動(dòng)物上的獲得免疫缺陷模型使臨床前細(xì)胞再生策略的綜合評(píng)價(jià)體系邁進(jìn)了一大步。

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Research progress of immunodeficient animal models using gene modification techniques

XIN Ji-ge1,2, ZENG Yang-zhi1*

(1. Key Laboratory of Banna Minipig Inbred Line of Yunnan Province, Kunming 650201, China;2. Animal Science and Technology College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201)

The established immunodeficient animal models could be used as valuable resource for mechanism research of related disease in humans, drug discovery and development, translational research and stem cell research. However, it is difficult and low-efficient to establish the genetic modified animal models using traditional technologies. The reports for immunodeficient animal models are few in middle-size and large animals. Recently, several effective gene-targeting tools, including ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9, develop quickly and provide technology basis for the establishment of immunodeficient animal models. In this paper, the technology principles and research progresses of ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 are introduced. The significant progresses of these emerging technologies achieved in immunodeficient animal models are also elaborated, including KORag1/Rag2 rabbit, KORag1/Rag2 pig, KOIL2rgpig, KOPpar-/Rag1 monkey, and so on. In addition to being models for researching SCID-related diseases in humans, and evaluating the efficacy and safety of stem-cell engraftment, these models may be also useful to develop surgical procedures for placement of grafts before clinical trials in humans, to produce humanized animals and bridge the gap between laboratory animal and medicical research. The immunodeficient animal models described here represent a step toward the comprehensive evaluation of preclinical cellular regenerative strategies.

Immunodeficiency; Animal models; Gene-targeting technology; Gene modification techniquesRaggene;IL2rggene

ZENG Yang-zhi， E-mail: zengyangzhi@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360532)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013FB041)；校博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2002374)。

信吉閣，女，講師，博士，研究方向：現(xiàn)代生物技術(shù)。E-mail： synlelovely@163.com

曾養(yǎng)志，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：遺傳學(xué)研究。E-mail： zengyangzhi@sina.com

研究進(jìn)展

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0535-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.018

2016-04-18