蔡冬慧 李燕 郭潤梅 張亭亭 陳志芳

·臨床研究與應(yīng)用·

宮頸癌HPV分型與Th17和Treg細(xì)胞的相關(guān)性研究*

蔡冬慧 李燕 郭潤梅 張亭亭 陳志芳

目的：檢測感染人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）患者的外周血中CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，分析Th17/Treg比值，比較血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)差異。方法：收集2014年9月至2016年6月119例新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院HPV感染未行治療患者的資料，分為宮頸癌（cervical cancer，CC）組46例、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ組43例、慢性宮頸炎（chronic cervicitis，CCS）組30例，根據(jù)檢測HPV分型將患者HPV感染分為高危型80例與低危型39例，流式細(xì)胞儀檢測Treg及Th17細(xì)胞，ELISA檢測相關(guān)細(xì)胞因子。結(jié)果：高危型HPV感染患者中CC組感染率為87％（40/46），顯著高于CINⅡ～Ⅲ組77％（33/43）及CCS組23％（7/30）。CC組外周血中Th17、Treg細(xì)胞及血清中相關(guān)細(xì)胞因子均明顯高于其他兩組，且隨著宮頸病變加重，Th17/Treg比值升高更加顯著。高危型HPV感染患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞高于低危型HPV感染患者（P＜0.05），Th17/Treg比值在高危型HPV感染患者中顯著升高。高危型HPV感染患者血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)較低危型HPV感染患者均顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論：Treg、Th17細(xì)胞在高危型HPV感染患者中存在增高現(xiàn)象，Th17/Treg比值的升高可能直接參與宮頸HPV的感染及免疫逃逸過程，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

宮頸癌人乳頭狀瘤病毒Treg細(xì)胞Th17細(xì)胞

宮頸癌（cervical cancer，CC）是威脅女性生命健康的主要惡性腫瘤之一，據(jù)2012年中國惡性腫瘤死亡與分析報道，宮頸癌在我國女性惡性腫瘤發(fā)病率中居第5位，在我國女性惡性腫瘤死亡率中居第8位［1］。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因。約80％婦女一生中曾感染過HPV病毒，但只有少部分持續(xù)感染者發(fā)展成為宮頸癌［2］。宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生與宮頸HPV的免疫逃逸存在密不可分的關(guān)系［3］。不同類型的T淋巴細(xì)胞在腫瘤的微環(huán)境中起著重要作用，Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞均屬于T淋巴細(xì)胞亞群，叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead or winged helix transcription 3，F(xiàn)oxp3）在Treg細(xì)胞中特異性表達(dá)，在Treg細(xì)胞免疫抑制作用中承擔(dān)重要角色。Th17細(xì)胞通過釋放IL-17細(xì)胞因子發(fā)揮促炎癥效應(yīng)，機(jī)體內(nèi)Th17/Treg比值的升高與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)［4］。本研究通過研究宮頸病變患者HPV分型與Th17/Treg比值改變及相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系，初步探討高危型及低危型宮頸HPV感染患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)，為宮頸癌的免疫防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料收集2014年9月至2016年6月119例新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院宮頸HPV感染未行治療患者的資料。分為宮頸癌（cervical cancer，CC）組46例，年齡36～60歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ組43例，年齡27～58歲；慢性宮頸炎（chronic cervicitis，CCS）組30例，年齡24～53歲。根據(jù)檢測HPV分型將患者HPV感染分為高危型80例與低危型39例。宮頸病變診斷以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。所有參加者均自愿簽署新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)的項目知情同意書。排除糖尿病、高血壓、心血管疾病、妊娠、急性或慢性感染性疾病或轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者。

1.1.2 試劑與儀器HPV核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒（購自廣東凱普生物化學(xué)有限公司）檢測多種HPV亞型，包括15種高危亞型、6種低危亞型。核酸分子快速雜交儀（購自廣東凱普生物化學(xué)有限公司）；Epics ALTRA型流式細(xì)胞儀（購自美國Beckman公司）；Bench Mark Plus型酶標(biāo)儀（購自美國Biorad公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（購自奧地利Bender MedSystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 宮頸HPV檢測將HPV檢測專用宮頸刷放置于宮頸，旋轉(zhuǎn)5～10圈，收集脫落細(xì)胞放置專門的保存液中。采用PCR技術(shù)行HPV分型檢測。

1.2.2 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞檢測對納入患者采靜脈血2 mL，EDTA抗凝。測定管中各加入100 mL抗凝血，加入相應(yīng)的抗體10 μL/管，避光，室溫，孵育20 min。加入Foxp3熒光抗體20 μL，避光，4℃，靜置30 min，加入破膜劑2 mL洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞染色液2 mL洗滌2次，0.5 mL細(xì)胞染色液重懸細(xì)胞混勻。流式細(xì)胞儀檢測樣本。

1.2.3 CD4+IL17+Th17細(xì)胞檢測RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板后加入佛波醇乙酯25 ng/mL、離子霉素1 μg/mL和莫能霉素1.7 μg/mL，在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，最終調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL。取測定試管及對照試管各1支分別加入100 μL細(xì)胞懸液和10 μL Fitc-CD4，避光，室溫，孵育15 min；PBS洗滌1次，兩管分別加入200 μL細(xì)胞破膜劑試劑A，避光、室溫、孵育15 min；PBS洗滌1次，重懸細(xì)胞，測定試管中加入200 μL破膜劑試劑B和10 μL PE-IL17A，對照試管中加入200 μL破膜劑試劑B和10 μL同型對照抗體PE，避光，室溫，孵育15～20 min；PBS洗滌1次。流式細(xì)胞儀檢測樣本。

1.2.4 細(xì)胞因子的檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，分別檢測各組血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23的水平，酶標(biāo)儀450 nm處讀吸光度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，均用±s表示；計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組患者高危型HPV感染率比較

CC組HPV感染率為87％（40/46）、CINⅡ～Ⅲ組為77％（33/43）、CCS組為23％（7/30），CC組與CINⅡ～Ⅲ組及CCS組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），CINⅡ～Ⅲ組及CCS組之間比較差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.23 組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/ Treg比值比較

對CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的外周血中CD4+IL17+Th17細(xì)胞百分率、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值進(jìn)行比較，CC組與CINⅡ～Ⅲ組及CCS組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），CINⅡ～Ⅲ組與CCS組之間比較差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.33 組患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)差異比較

對CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子進(jìn)行比較，CC組與CINⅡ～Ⅲ組及CCS組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），CINⅡ～Ⅲ組與CCS組之間比較差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.4 高危型與低危型HPV感染患者的外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較

對高危型與低危型HPV感染患者的外周血中CD4+IL17+Th17細(xì)胞百分率、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值進(jìn)行比較，高危型HPV感染患者顯著高于低危型HPV感染患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.5 高危型與低危型HPV感染患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)差異比較

對高危型與低危型HPV感染患者的血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子進(jìn)行比較，高危型HPV感染患者顯著高于低危型HPV感染患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

表1 CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較（±s）Table 1Comparison of Th17 and Treg cell percentages and Th17/Treg ratio in the peripheral blood of patients among CC,CINⅡ-Ⅲ,and CCS groups (±s)

表1 CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較（±s）Table 1Comparison of Th17 and Treg cell percentages and Th17/Treg ratio in the peripheral blood of patients among CC,CINⅡ-Ⅲ,and CCS groups (±s)

Group CCS CINⅡ-ⅢCC Percentage of CD4+IL17+Th17(％) 1.34±0.64 3.09±1.28 3.96±1.15 Percentage of CD4+CD25+Foxp3+Treg(％) 2.28±1.18 4.34±1.32 5.29±1.11 Th17/Treg ratio 0.60±0.08 0.69±0.11 0.74±0.07

表2 CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子表達(dá)差異比較（±s，pg/mL）Table 2Comparison of IL-17,IL-10,TGF-β,and IL-23 cytokines in the serum of patients among CC group,CINⅡ-Ⅲgroup,and CCS group(±s,pg/mL)

表2 CC、CINⅡ～Ⅲ、CCS組患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子表達(dá)差異比較（±s，pg/mL）Table 2Comparison of IL-17,IL-10,TGF-β,and IL-23 cytokines in the serum of patients among CC group,CINⅡ-Ⅲgroup,and CCS group(±s,pg/mL)

Group CCS CINⅡ-ⅢCC IL-17 56.97±18.18 183.91±24.14 198.89±28.14 IL-10 21.83±9.02 73.63±46.50 122.28±28.15 TGF-β 22.60±7.37 39.70±14.70 51.15±13.66 IL-23 26.93±8.28 113.74±13.74 122.50±18.13

表3 高危型與低危型HPV感染患者的外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較（±s）Table 3Comparison of Th17 and Treg cell percentages and Th17/Treg ratio in peripheral blood of high-and low-risk HPV patients(±s)

表3 高危型與低危型HPV感染患者的外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較（±s）Table 3Comparison of Th17 and Treg cell percentages and Th17/Treg ratio in peripheral blood of high-and low-risk HPV patients(±s)

Group Low-risk High-risk Percentage of CD4+IL17+Th17(％) 1.62±0.93 3.65±1.25 Percentage of CD4+CD25+Foxp3+Treg(％) 2.45±1.11 5.03±1.20 Th17/Treg ratio 0.61±0.09 0.72±0.09

表4 高危型與低危型HPV感染患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子表達(dá)差異比較（±s，pg/mL）Table 4Comparison of IL-17,IL-10,TGF-β,and IL-23 cytokines in the serum of high-and low-risk HPV patients(±s,pg/mL)

表4 高危型與低危型HPV感染患者的血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子表達(dá)差異比較（±s，pg/mL）Table 4Comparison of IL-17,IL-10,TGF-β,and IL-23 cytokines in the serum of high-and low-risk HPV patients(±s,pg/mL)

Group Low-risk High-risk IL-17 96.08±58.07 187.74±41.07 IL-10 31.23±27.50 102.85±43.73 TGF-β 26.79±10.93 46.16±15.70 IL-23 57.13±37.12 46.16±15.70

3 討論

HPV病毒是一種環(huán)狀雙鏈DNA病毒［2］，目前分離的HPV病毒約120余種，多種疾病與HPV感染相關(guān)，包括泌尿生殖系統(tǒng)及口咽部腫瘤等［5］。HPV分為3個基因區(qū)，包括2個編碼區(qū)和1個非編碼區(qū)，編碼區(qū)包括E區(qū)和L區(qū)，E編碼區(qū)編碼的E1、E2蛋白與病毒復(fù)制相關(guān)，E6、E7蛋白可誘導(dǎo)p53和Rb抑癌基因的失活，誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生［3］。高危型HPV E6/E7 mRNA的檢出率在宮頸癌患者為76％，顯著高于健康體檢者，且隨著宮頸病變加重HPV E6/E7 mRNA的陽性率越高［6］。根據(jù)致病力，可將HPV分為高危型及低危型。研究證明高危型宮頸HPV持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密不可分［2］。

隨著宮頸HPV疫苗的問世及臨床應(yīng)用，宮頸癌的免疫治療成為熱門研究方向。目前HPV的免疫逃逸機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞可能參與宮頸HPV的免疫逃逸［3］。Treg細(xì)胞主要發(fā)揮免疫抑制作用，與許多腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān)，包括乳腺癌、宮頸癌等，外周血中Treg細(xì)胞的百分率升高與腫瘤的分期、大小及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［7-8］。Foxp3+Treg細(xì)胞百分率的升高往往提示疾病結(jié)局不良［7，9］。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是最具代表性的Treg細(xì)胞，F(xiàn)oxp3在CD4+CD25+Treg細(xì)胞中特異性表達(dá)，為CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育必須的轉(zhuǎn)錄因子［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞與TGF-β、IL-10、IL-6細(xì)胞因子呈正相關(guān)［4］。Th17與IL-6、IL-23、IL-17細(xì)胞因子呈正相關(guān)［4，10］。Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在自身免疫性疾病、感染性疾病中發(fā)揮重要作用。腫瘤患者的外周血中同樣存在Th17細(xì)胞高表達(dá)，但Th17細(xì)胞在腫瘤作用機(jī)制尚不明確。研究認(rèn)為Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞存在平衡狀態(tài)，機(jī)體這種平衡狀態(tài)被打破更易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［10-13］。本研究通過檢測高危型和低危型HPV感染患者的外周血Treg和Th17細(xì)胞的表達(dá)，分析Th17/Treg比值，比較血清中IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)差異，初步了解Treg、Th17細(xì)胞以及二者的比值改變與HPV免疫逃逸的關(guān)系，從而為宮頸癌的病情監(jiān)測提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，CC組患者高危型HPV感染率顯著高于CINⅡ～Ⅲ組及CCS組（P＜0.05），高危型宮頸HPV的篩查對預(yù)防CIN及CC的發(fā)生有著重要意義［2］。在CC組患者的外周血中CD4+IL17+Th17細(xì)胞百分率、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率、Th17/Treg比值及血清中相關(guān)細(xì)胞因子顯著高于CINⅡ～Ⅲ組及CCS組，說明Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞很可能參與CC的發(fā)生，Th17/Treg比值的改變與宮頸病變程度相關(guān)［14］。為進(jìn)一步研究HPV分型與Th17/Treg比值及相關(guān)細(xì)胞因子間的關(guān)系，本研究依據(jù)HPV分型將納入患者分為高危型HPV感染與低危型HPV感染，發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染患者外周血中CD4+IL17+Th17細(xì)胞百分率、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值顯著高于低危型HPV感染患者。高危型HPV感染患者的血清中IL-10、IL-17、TGF-β、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)高于低危型，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高危型宮頸HPV可能通過誘導(dǎo)外周血中Th17/Treg比值的升高，改變機(jī)體免疫平衡狀態(tài)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究推測Treg、Th17細(xì)胞很可能參與高危型HPV誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的免疫逃逸過程，通過調(diào)控機(jī)體內(nèi)Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞比值的平衡以抑制高危型HPV持續(xù)感染，有助于降低宮頸癌的發(fā)生率，對監(jiān)測宮頸病變發(fā)展及預(yù)后具有一定意義。

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（2016-09-29收稿）

（2016-12-06修回）

（編輯：張抿 校對：周曉穎）

Correlation of HPV types with Th17 and Treg cells in cervical cancer

Donghui CAI,Yan LI,Runmei GUO,Tingting ZHANG,Zhifang CHEN

Zhifang CHEN;E-mail:645286940@qq.com
Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China
This work was supported by the Urumqi Key Laboratory of Infection and Tumor(No.WIT-2013-02)and the Key Laboratory of Major Diseases of Xinjiang(No.SKLIB-XJMDR-2014-5)

Objective:Based on the detection of CD4+IL17+Th17 and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in the peripheral blood of patients with human papilloma virus(HPV),the study analyzes the ratio of Th17 to Treg and compares the different expression of cytokine IL-17,IL-10,TGF-β,and IL-23 in the serum.Methods:From September 2014 to June 2016,119 cases of untreated patients with cervical HPV infection were collected at the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,which include 46 cases of cervical cancer(CC),43 cases with cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅱ-Ⅲ,and 30 with chronic cervicitis(CCS).The detection of HPV types classified 80 patients as high-risk and 39 as low-risk.Flow cytometry examined Treg and Th17 cells,and enzyme-linked immune sorbent assay was used to test related cytokines.Results:In the infection of high-risk cervical HPV,the rate of the CC group was 87％(40/46),which was higher than that of the CINⅡ-Ⅲgroup and the CCS group,which were 77％(33/43)and 23％(7/30),respectively.For the expression of Th17 and Treg cells in the peripheral blood and the related cytokine IL-17,IL-23,TGF-β,and IL-10 in the serum,the levels of CC group were also significantly higher than that of the other two groups,and the ratio of Th17 to Treg increased considerably with the severity of cervical lesions.The expression of Th17 and Treg cells in the peripheral blood of patients with high-risk cervical HPV were higher than that of patients with low-risk cervical HPV(P＜0.05),which was the same for the expression of the related cytokine IL-17,IL-23,TGF-β,and IL-10 in the serum.The ratio of the Th17 to Treg of patients with high-risk cervical HPV increased remarkably(P＜0.05). Conclusion:The expression of Treg and Th17 cells in high-risk patients exhibits an increasing trend,and the ratio of increased Th17 to Treg may directly participate in the process of HPV infection and immune evasion,which plays an important role in the occurrence and development of cervical cancer.

cervical cancer,human papilloma virus,Treg cells,Th17 cells

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.24.137

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科（烏魯木齊市830054）

*本文課題受新疆烏魯木齊市感染與腫瘤重點(diǎn)實驗室項目（編號：WIT-2013-02）與新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室開放課題項目（編號：SKLIB-XJMDR-2014-5）資助

陳志芳645286940@qq.com

蔡冬慧專業(yè)方向為婦科腫瘤臨床治療及基礎(chǔ)研究。

E-mail：137617265@qq.com