王世會，賈智英，李池陶，孫志鵬，石連玉

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

錦鯉皰疹病毒ORF72基因克隆及結(jié)構(gòu)功能分析

王世會，賈智英，李池陶，孫志鵬，石連玉

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

于遼寧丹東采集感染錦鯉皰疹病毒的活鯉Cyprinus carpio樣品，經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增、重組質(zhì)粒構(gòu)建步驟成功克隆錦鯉皰疹病毒ORF72基因，并利用生物信息學(xué)軟件分析ORF72蛋白結(jié)構(gòu)與功能，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：ORF72基因開放閱讀框共1113bp，編碼蛋白由370個氨基酸組成，理論相對分子質(zhì)量為40.5KD；ORF72蛋白主要由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲3種二級結(jié)構(gòu)組成；N端35個氨基酸序列為信號肽序列?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明：ORF72蛋白無跨膜區(qū)，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明ORF72含有一個保守結(jié)構(gòu)域，抗原表位分析表明，抗原性較好。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示：ORF72氨基酸序列存在2個潛在的N-糖基化位點、1個潛在的O-糖基化位點、19個潛在的磷酸化位點。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，其與錦鯉皰疹病毒美國株、以色列株屬同一分支。

錦鯉皰疹病毒；ORF72基因；結(jié)構(gòu)功能分析

鯉Cyprinus carpio是全世界養(yǎng)殖最廣泛的淡水魚，養(yǎng)殖地區(qū)主要分布在亞洲、歐洲和中東地區(qū)，其中錦鯉Cyprinus carpio koi是重要的觀賞性魚類[1]。20世紀(jì)末開始爆發(fā)的錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease，KHVD）嚴(yán)重影響了鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。該病傳染性和致病性高，主要感染鯉和錦鯉[3]，臨床表現(xiàn)為行動緩慢，鰓出血并伴有大量壞死，尾鰭基部充血，皮膚皰疹性損傷與侵蝕[1]。在水溫18～28℃時均可發(fā)病，其中22～24℃病毒感染力最強(qiáng)[4]。

1988年錦鯉皰疹病毒病首次在以色列發(fā)生，鯉和錦鯉的死亡率高達(dá)75%～95%[5]，隨后在全世界范圍內(nèi)迅速擴(kuò)展，美國、德國、英國、日本、印度尼西亞、韓國等相繼報道了該病[6]。2002年，我國廣東省首次報道該病[7]，同年12月臺灣也報道了該病[8]，并引起了世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和世界糧農(nóng)組織（FAO）的高度關(guān)注。對錦鯉皰疹病毒的研究始于1997年美國建立的錦鯉鰭條細(xì)胞系KF[9]。隨后以色列和美國科研人員成功獲得了該病毒株并進(jìn)行感染實驗，證實這種病毒正是各國錦鯉死亡的主要誘因[10]。

錦鯉皰疹病毒（KHV）又稱鯉皰疹病毒3型（CyHV-3），與鯉痘瘡病毒（CyHV-1）和金魚造血器官壞死病毒（CyHV-2）同為鯉皰疹病毒屬Cyprinivirus[11]。KHV是單一線性雙鏈 DNA病毒，直徑約170～200nm，是魚類最大的皰疹病毒[13]，核酸被衣殼蛋白包裹，成熟病毒含有囊膜蛋白[12]。2007年，基因組測序全面完成，基因組大小約為295kb[14]。KHV具有156個開放閱讀框（ORFs），至少包含5個家族基因：其中ORF2編碼腫瘤壞死因子受體；ORF25、ORF26、ORF27、ORF65、ORF148和ORF149編碼膜糖蛋白[1]；ORF72編碼衣殼蛋白；ORF81和ORF83編碼囊膜蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，可以誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生中和抗體[15]。

本研究從感染錦鯉皰疹病毒的活鯉中提取DNA，利用兩對KHV特異性引物檢測病毒DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆ORF72基因，測序分析、比對，分析其生物學(xué)功能，為闡明病毒侵染鯉的機(jī)制，防治錦鯉皰疹病毒病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在遼寧丹東采集20尾感染錦鯉皰疹病毒的活鯉樣品，用冰袋保存帶回實驗室，采集病魚肝胰臟、腎、脾、腦、心、鰓、肌肉、腸等組織，液氮速凍后，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I購自大連寶生物工程有限公司；Tryptone和Yeast Extract購自O(shè)xoid公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；Escherichia coli DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)。

1.2 引物設(shè)計及合成

根據(jù)Gene Bank中登錄號（NC_009127.1）獲得錦鯉皰疹病毒美國株（KHV-U）的ORF72基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，擴(kuò)增ORF72基因開放閱讀框序列（表1）。其中GGTACC為Kpn I酶切位點；GAATTC為EcoR I酶切位點。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 KHV-DD株病毒DNA提取

采用磁珠法組織DNA提取試劑盒（MagPure Tissue DNA KF Kit）提取DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。取出部分DNA稀釋至50μg/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 KHV-DD株ORF72基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增在Biometra PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25μL，包括：2×ES Taq混合液12.5μL；正反向引物（10μmol/L）各1μL；DNA稀釋液模板1μL；最后加ddH2O補充至25μL。PCR反應(yīng)條件如下：首先94℃預(yù)變性2min；然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 KHV-DD株ORF72基因PCR克隆及雙酶切鑒定

ORF72基因PCR產(chǎn)物切膠回收，與pMD18-T載體連接，室溫連接30min后，4℃冰箱中連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂到含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基（預(yù)先涂有X-gal和IPTG）上篩選菌落。挑選白色單菌落置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃160r/min搖床中過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)。利用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定篩選出含有陽性重組質(zhì)粒的菌液，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表1 引物序列信息Tab.1 The information on the primer sequences in the experiment

1.6 KHV-DD株ORF72基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析

利用DNAStar（Editseq）軟件翻譯出ORF72基因的氨基酸序列，分析蛋白分子特征；利用DNAman 6.0軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；利用Signal P4.1在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽序列[16]；應(yīng)用TMHMM Serverv.2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析氨基酸跨膜區(qū)域[17]；采用DNAStar 6.0（Protean）軟件分析抗原表位；蛋白質(zhì)翻譯后修飾中N-糖基化位點和 O-糖基化位點預(yù)測利用 NetNGlyc1.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線分析軟件；磷酸化位點預(yù)測采用NetPhos 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析[18]；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，判斷親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

2 結(jié)果與分析

2.1 KHV-DD株ORF72基因PCR擴(kuò)增

圖1 錦鯉皰疹病毒ORF72基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of koi herpes virus ORF72 gene

圖2 菌液PCR檢測結(jié)果Fig.2 The results of bacteria liquid PCR

圖3 錦鯉皰疹病毒ORF72基因的雙酶切鑒定Fig.3 The identification of koi herpes virus ORF72 gene using double restriction enzymes digestion

PCR擴(kuò)增到與目的條帶大小一致的1113bp的DNA片段（圖1）。T-A克隆菌液PCR檢測和重組質(zhì)粒Kpn I、EcoR I雙酶切鑒定的結(jié)果（圖2、圖3）說明，ORF72基因已成功連接到載體中。

2.2 KHV-DD株ORF72基因結(jié)構(gòu)與功能分析

2.2.1 ORF72基因的序列測定和編碼蛋白分子特征

測序結(jié)果經(jīng)DNAStar（Editseq）軟件分析可知，該基因開放閱讀框長1 113bp，預(yù)測編碼一個含有370個氨基酸（圖4）、相對分子質(zhì)量為40.5KD、等電點5.750的前體蛋白；蛋白中含有30個強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），38個強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），116個疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V），100個極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。

圖4 ORF72基因核酸與氨基酸序列對應(yīng)表Fig.4 Nucleic acid and amino acid sequences corresponding to ORF72 gene

2.2.2 ORF72蛋白二級結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)測序結(jié)果，應(yīng)用DNAman 6.0軟件預(yù)測ORF72蛋白中共有3種二級結(jié)構(gòu)：α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲。這3種結(jié)構(gòu)分別位于以下氨基酸中（圖5）：α螺旋（Helix）位于第13～18、26～32、89～98、163～169、192～205、222～228、255～264、267～279、296～299、304～312、316～321位氨基酸上；β折疊（Strand）位于第45～49、54～57、66～69、84～86、99～101、108～114、133～136、149～151、178～181、208～212、232～244、329～333、343～348、362～366位氨基酸上；無規(guī)則卷曲（Coil）位于第1～12、19～25、33～44、50～53、58～65、70～83、87～88、102～107、115～132、137～148、152～162、170～177、182～191、206～207、213～221、229～231、245～254、265～266、290～295、300～303、313～315、322～328、334～342、349～361、367～370位氨基酸上。

2.2.3 ORF72蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用NCBI網(wǎng)站中Conserved domains預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示ORF72含有一個保守結(jié)構(gòu)域，為PHA03260 super family（圖6）。

2.2.4 信號肽分析

根據(jù)測序結(jié)果，采用http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/SignalP網(wǎng)址進(jìn)行在線分析，通過Singal P4.1在線預(yù)測信號肽切割位點。預(yù)測結(jié)果為N端35個氨基酸可能是信號肽切割位點，序列為MYGLNSAS GFLDTEWVEKQGMVTPPEEVAKMLNPH（圖7）。

2.2.5 跨膜區(qū)分析

根據(jù)測序結(jié)果，經(jīng)TMHMM Serverv.2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析，ORF72蛋白無跨膜區(qū)。

圖5 ORF72蛋白二級結(jié)構(gòu)特征Fig.5 Secondary structure features of ORF72 protein

圖6 ORF72蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 The prediction of conserved domains in ORF72 protein

圖7 ORF72蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.7 The prediction of signal peptide in ORF72 protein of koi herpes virus

2.2.6 抗原表位分析

根據(jù)測序結(jié)果及DNAStar（Editseq）軟件分析出的氨基酸序列，采用DNAStar6.0（Protean）軟件分析抗原表位。結(jié)果表明：抗原表位主要集中在第14～30、37～45、55～70、73～94、113～122、130～145、148～164、171～181、185～195、214～222、229～240、280～292、330～343位氨基酸上（圖8）。

圖8 ORF72蛋白抗原表位分析Fig.8 The prediction of the antigenic determinants of koi herpes virus ORF 72 protein

圖9 ORF72蛋白N-糖基化位點預(yù)測Fig.9 The prediction of N-glycosylation site in ORF72 protein

圖10 ORF72蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.10 The prediction of phosphorylation sites in ORF72 protein

圖11 錦鯉皰疹病毒丹東株ORF72基因比對結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果Fig.11 The alignment and phylogenetic tree based on ORF72 gene in koi herpes virus-DD

2.2.7 糖基化及磷酸化位點的預(yù)測

應(yīng) 用 NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc4.0（http:∥www.cbs.dtu. dk/services/NetOGlyc/）預(yù)測錦鯉皰疹病毒ORF72的N-糖基化位點和O-糖基化位點，結(jié)果表明：其氨基酸序列存在2個潛在的N-糖基化位點（圖9），1個潛在的O-糖基化位點。應(yīng)用NetPhos 2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線分析軟件預(yù)測磷酸化位點，結(jié)果表明：當(dāng)閾值為0.5時，ORF72氨基酸序列中存在19個潛在的磷酸化位點（圖10）。

2.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

在NCBI中對測序結(jié)果直接進(jìn)行Blast分析（圖11）。錦鯉皰疹病毒丹東株（KHV-DD）與廣東株（KHV-GZ）、美國株（KHV-U）、以色列株（KHV-I）同源性均為 100%，與錦鯉皰疹病毒日本株（KHV-J）同源性為99%。根據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，KHV-DD與KHV-I、KHV-U處于一個分支，而KHV-J處于另一個分支。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是20世紀(jì)末確定的一種疾病，現(xiàn)已在全球范圍內(nèi)爆發(fā)，嚴(yán)重威脅鯉和錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)安全，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須申報的疾病，為我國二類疫病。目前對該病的防治已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，以色列科學(xué)家曾通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式獲得傳代細(xì)胞系和致病力弱的毒株[19,20]，直接接種錦鯉和普通鯉，可以起到很好的免疫作用。而我國對該病的防治主要停留在使用抗生素階段，治療效果并不理想。大劑量抗生素的使用導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性和變異，從而更難徹底根除此病。因此研制對魚體和食用者更安全、對環(huán)境更環(huán)保的病毒疫苗或病毒抗體是解決病毒病的關(guān)鍵[21]。錦鯉皰疹病毒衣殼蛋白是病毒的重要組成部分。Rosenkranz等[22]研究表明：部分表達(dá)衣殼蛋白的基因可作為檢測或者免疫的候選基因。本文通過克隆錦鯉皰疹病毒衣殼蛋白基因ORF72，分析其蛋白結(jié)構(gòu)與功能，為錦鯉皰疹病毒抗體制備提供基礎(chǔ)。

本研究成功地獲得錦鯉皰疹病毒衣殼蛋白ORF72基因開放閱讀框序列，共1 113bp。應(yīng)用DNAstar 6.0軟件分析可知，其編碼大小約40.5KD的前體蛋白，等電點為5.750。信號肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，主要由疏水性氨基酸組成，對蛋白的轉(zhuǎn)運具有重要作用[23]。因此，預(yù)測信號肽切割位點，能夠為蛋白原核表達(dá)研究提供重要信息，信號肽位點對原核表達(dá)引物設(shè)計起提示性作用。應(yīng)用SingalP4.1在線軟件進(jìn)行信號肽切割位點預(yù)測顯示，蛋白質(zhì)N端35個氨基酸很有可能是信號肽序列。應(yīng)用 TMHMM Server v.2.0在線分析顯示：衣殼蛋白ORF72無跨膜區(qū)域。DNAman軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)顯示：ORF72蛋白由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)組成。蛋白質(zhì)的功能部位與酶的活動中心通常由無規(guī)則卷曲充當(dāng)，而α螺旋和β折疊一般只起支撐作用。因此預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有助于分析蛋白功能和活動中心。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示：ORF72含有一個保守結(jié)構(gòu)域，為PHA03260 super family?？乖砦环治霰砻髟摰鞍椎谋砻婵乖瓫Q定簇分布區(qū)域廣泛?？乖砦患纯乖瓫Q定簇，是指由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成，決定抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)。抗原表位是免疫細(xì)胞識別抗原分子的重要部位，因此有效地分析抗原表位有助于免疫干預(yù)治療等[24]。蛋白質(zhì)糖基化屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，對蛋白質(zhì)功能具有重要影響[25]。根據(jù)Gunn等[26]研究成果可知，病毒的抗原性與N-糖基化作用位點密切相關(guān)。蛋白質(zhì)磷酸化也是翻譯后修飾的重要過程。

測序結(jié)果表明：錦鯉皰疹病毒丹東株與美國株、以色列株序列完全一致，與日本株只有一個堿基差異。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：錦鯉皰疹病毒丹東株與美國株、以色列株同源性100%，與日本株同源性99%。推測錦鯉皰疹病毒丹東株可能由美國或以色列等國家傳播，也可能由日本株變異而來。

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Cloning and Functional Analysis of ORF72 Gene in Koi Herpes Virus

WANG Shi-hui，JIA Zhi-ying，LI Chi-tao，SUN Zhi-peng，SHI Lian-yu
（Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The samples of common carp（Cyprinus carpio kio）infected with koi herpes virus were collected from Dandong area in Liaoning province,and ORF72 gene was successfully cloned by DNA extraction,PCR amplification,and plasmid recombination to analyze the structure and function of ORF72 gene and to construct a phylogenetic tree.The ORF72 was found to be composed of 1113 nucleotides encoding a protein of 370 amino acids with a molecular weight of 40.5 KD.The ORF72 secondary structure was primarily comprised of α helix,β strand,and random coil,and contained a conserved domain with N-terminal 35 residues as the signal peptides.Online analysis revealed that there was no transmembrane region in the ORF72 showing good antigenicity.The protein structure analysis indicated that there were two N-glycosylation sites,one O-glycosylation site and 19 phosphorylation sites.Phylogenetic analysis showed that ORF72 gene of KHV-DD was in the same branch with the USA and Israel strains．

Koi herpes virus;ORF72 gene;structure and function analysis

S917

A

1005-3832（2016）03-0009-07

2016-01-08

國家科技支撐計劃（2012BAD26B01）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-46-02）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（HSY201401）.

王世會（1986-），男，研究實習(xí)員，碩士，從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究.E-mail:hrfriwsh@yeah.net

石連玉（1960-），男，研究員，從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究.E-mail:sly2552@aliyun.com