戚瑞榮，唐紹林，崔龍波，雷燕，馬家好

（1.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

羅非魚類立克次氏體病的組織病理學(xué)觀察

戚瑞榮1，2，唐紹林1，2，崔龍波3，雷燕1，2，馬家好1，2

（1.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

本文主要研究感染類立克次氏體（Rickettsia-like organism，RLO）的養(yǎng)殖羅非魚（Oreochromis aureus♂× Oreochromis niloticus♀）肝、脾、腎、腸、鰓和心臟的組織病理變化。感染類立克次氏體的羅非魚各器官廣布粗糙不圓整的白色小結(jié)節(jié)，這些結(jié)節(jié)為肉芽腫壞死灶，分層不典型，與周圍健康組織的界限不甚明顯；嚴(yán)重病變的組織壞死區(qū)域較大，與周圍明顯增生的細(xì)胞形成清晰的巨大“肉瘤”狀腫物。經(jīng)吉姆薩-瑞氏染色后，在病變組織內(nèi)，尤其是脾腎組織的巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見藍(lán)紫色球狀或顆粒樣、成簇分布的類立克次氏體。這些發(fā)現(xiàn)可為羅非魚類立克次氏體病的病理學(xué)診斷提供依據(jù)。

類立克次氏體；羅非魚；組織病理；組織印片；吉瑞染色

立克次氏體（Rickettsia）系龐大的家族，為多形性革蘭氏陰性菌，直徑0.5～1.5μm，專性細(xì)胞內(nèi)寄生，在宿主組織細(xì)胞有膜結(jié)合的胞質(zhì)空泡內(nèi)復(fù)制[1]，人和多種動物包括魚都可感染發(fā)病，是導(dǎo)致國內(nèi)外魚類發(fā)生嚴(yán)重傳染病的病原體類群[2]。

Mohamed等在埃及發(fā)病的河鲀Tetrodon fahaka體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)類立克次氏體。自20世紀(jì)90年代以來，魚立克次氏體病及其綜合癥已經(jīng)遍布多個(gè)國家和地區(qū)，感染十幾種經(jīng)濟(jì)魚種，包括細(xì)鱗Brachymystax lenok tsinlingensis、大麻哈魚Oncorhynchus gorbuscha Walbaum、大鱗大麻哈魚 Oncorhynchus tshawytscha、銀鮭Oncorhynchus kisutch、大西洋鮭Salmo salar等[2-8]。鮭科魚類立克次氏體病的特征主要是腸、腎、肝和脾等器官有彌漫性的發(fā)炎和壞死，肝靠近血管的部位有獨(dú)特的彈坑狀損傷，在巨噬細(xì)胞和其他感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以觀察到立克次氏體[4,5]。非鮭科魚類如石斑魚Epinephelus melanostigma、羅非魚Oreochromis niloticus、藍(lán)眼清道夫Panaque suttoni、真鯛Pagrosomus major等感染類立克次氏體也出現(xiàn)與鮭立克次氏體（Piscirickettsia salmonis gen.nov.,sp.nov.）病相似的癥狀和病理變化[2,9-11]。臺灣石斑魚感染類立克次氏體后，內(nèi)臟組織器官充血，血管可見血栓性損傷、壞死，有結(jié)節(jié)，感染的組織細(xì)胞有大空泡[11]。電鏡觀察臺灣患病的羅非魚細(xì)胞中桑葚狀包涵體內(nèi)有魚類立克次氏體[12]。真鯛類立克次氏體引起魚前腸、中腸和后腸的嚴(yán)重水腫及空腸狀態(tài)，腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和微絨毛中有大量類立克次氏體樣原核生物及其在發(fā)生基質(zhì)內(nèi)存在“裝配”增殖現(xiàn)象[13]。

本文通過觀察云南患病羅非魚肝、脾、腎、腸、鰓、心的組織切片發(fā)現(xiàn)，羅非魚組織中的白色結(jié)節(jié)是由類立克次氏體引起，進(jìn)而研究羅非魚感染類立克次氏體后各器官的組織病理變化，為該病的臨床診斷提供組織病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染發(fā)病的羅非魚采自云南省寧河縣當(dāng)?shù)亓_非魚養(yǎng)殖場，現(xiàn)場觀察記錄感染魚的臨床及解剖學(xué)特征。

1.2 組織切片的制備

取病變器官肝、脾、腎、腸、鰓、心的組織塊，固定于Bouin's液中，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片（厚度5μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色，光鏡觀察。

1.3 組織印片的制備及染色

取病變器官組織，用解剖刀將組織切割出一個(gè)整齊的切面，將此切面平行印在載玻片上（輕觸一下載玻片即可），待組織印面稍干后，用甲醇固定1min，晾干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對組織印片染色時(shí)，先用吉姆薩染液染色15～20min，然后不經(jīng)水洗直接滴加瑞氏染液染色1min，水洗、晾干，樹膠封片后（也可不封片直接鏡檢）于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染類立克次氏體的羅非魚的癥狀及解剖學(xué)特征

2010年冬季首次在云南發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖羅非魚出現(xiàn)病癥，之后每年10月～翌年5月中旬低溫期（水溫17～25℃）均發(fā)病。感染類立克次氏體的羅非魚在水中上浮、靠邊，中午和下午會上來“停尸”（即停在水面一動不動，有人靠近時(shí)或會游走），死亡前常常打轉(zhuǎn)。羅非魚內(nèi)臟組織尤其是脾、腎組織可見白色結(jié)節(jié)，呈嚴(yán)重的“肉瘤”狀（圖1）。

2.2 感染類立克次氏體的羅非魚內(nèi)臟組織病理變化

切片觀察發(fā)現(xiàn)：感染類立克次氏體的羅非魚肝、脾、腎、心組織中均出現(xiàn)肉芽腫結(jié)節(jié)性壞死灶，這些壞死灶長橢圓形、邊界不圓整、分層不典型，常多個(gè)大小不一的壞死灶融合在一起；壞死灶與周圍組織界限不清；肝組織中可見少量肉芽腫壞死灶，肝細(xì)胞固縮、有崩解（圖2-1、圖2-2）；脾組織中可見大量的肉芽腫壞死灶，淤血，脾實(shí)質(zhì)組織細(xì)胞崩解、消失（圖2-3、圖2-4）；腎組織中有大量肉芽腫壞死灶，腎固有組織細(xì)胞崩解、消失（圖2-5、圖2-6）；腸腔內(nèi)有少量食物及少量脫落壞死細(xì)胞，腸上皮近腔端有壞死；鰓輕微淤血，鰓小片上皮腫脹，細(xì)胞脫落、壞死、溶解，形成許多溶解性的空腔，鰓小片間輕微細(xì)胞增生；心肌中可見個(gè)別肉芽腫，心肌纖維壞死（圖2-7、圖2-8）。綜合發(fā)病羅非魚的剖檢特征和組織病變特征，最具病理診斷意義的特征是：各器官普遍出現(xiàn)白色小結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)粗糙、不圓整；這些結(jié)節(jié)的顯微結(jié)構(gòu)為肉芽腫壞死灶，與周圍健康組織的界限不甚明顯，分層不典型；嚴(yán)重病變的組織、壞死區(qū)域和周圍明顯的細(xì)胞增生形成清晰的大“肉瘤”狀腫物。

圖1 羅非魚患類立克次氏體病時(shí)內(nèi)臟組織的外觀特征Fig.1 Visceral tissue characteristics in tilapia diseased by rickettsia-like organism（RLO）

2.3 感染類立克次氏體的羅非魚內(nèi)臟組織印片染色結(jié)果

發(fā)病羅非魚內(nèi)臟組織印片經(jīng)吉瑞染色后，在脾、腎的巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)觀察到藍(lán)紫色、球狀或顆粒樣、成簇的菌體（圖3），初步確定為類立克次氏體。

圖2 患類立克次氏體病的羅非魚組織病變特征Fig.2 Histopathological characteristics in tilapia diseased by RLO

圖3 患類立克次氏體病的羅非魚組織印片F(xiàn)ig.3 The tissue imprints stained with Giemsa-Wright in tilapia diseased by RLO

3 討論

無論是鮭科魚類，還是非鮭科魚類，感染類立克次氏體后的病理解剖學(xué)特征和最具病理診斷意義的特征都是內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)[4,5,9,11]。感染類立克次氏體的羅非魚肝、脾、腎等組織，尤其是脾腎組織，均有大量乳白色或灰白色的結(jié)節(jié)，嚴(yán)重的呈巨大“肉瘤”狀腫物。這些乳白色或灰白色的“肉瘤”樣大結(jié)節(jié)，在光鏡下為大小不一融合在一起的多個(gè)肉芽腫。肉芽腫普遍存在，但在各組織中的數(shù)量及其中心壞死區(qū)的大小等有差異。感染RLO的羅非魚的病變特征為組織細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死及存在大量的慢性肉芽腫炎癥，與其他魚類和合浦珠母貝Pinctada fucata的病變相似[4,5,9,11,14]。郭瓊林等[15]在感染RLO的烏鱧Ophiocephalus argus的肝、脾、腎等組織中也觀察到類似的肉芽腫。但病變較嚴(yán)重的羅非魚組織中，較大的組織壞死區(qū)域和周圍明顯的炎性增生形成邊界清楚可見的類似“腫瘤”樣的團(tuán)塊，即本文中病檢時(shí)觀察到的巨大“肉瘤”狀腫物。

檢測魚立克次氏體的“金標(biāo)準(zhǔn)”是用易感魚類的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)[16]，但檢測條件比較苛刻，現(xiàn)場很難進(jìn)行無菌操作，且魚立克次氏體對低濃度抗生素敏感，不適合現(xiàn)場檢測。有研究人員利用血瓊脂培養(yǎng)基成功分離培養(yǎng)出鮭立克次氏體[17]，但培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高，現(xiàn)在還沒有標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法。目前一般用組織印片或者涂片的吉姆薩染色、革蘭氏染色等判定類立克次氏體。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吉姆薩-瑞氏染色后比較容易觀察到組織印片中的類立克次氏體。

羅非魚類立克次氏體形成的結(jié)節(jié)與單純諾卡氏菌感染引起的分層明顯的典型結(jié)節(jié)不同[18]：前者外觀不圓整、連成一片；組織切片光鏡下觀察，結(jié)節(jié)分層不典型，與周圍健康組織分界不明顯，常多個(gè)大小不一的結(jié)節(jié)性壞死灶融合在一起。

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Histopathological Observation of Disease of Rickettsia-like Organism in Tilapia（Oreochromis niloticus）

QI Rui-rong1,2,TANG Shao-lin1,2,CUI Long-bo3,LEI Yan1,2,MA Jia-hao1,2
（1.Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 2.Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 3.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China）

The histopathological changes in liver,spleen,kidney,intestine,gill and heart were described in tilapia（Oreochromis aureus♂×Oreochromis niloticus♀）infected by rickettsia-like organism（RLO）.The tilapia infected by RLO is most pathologically and anatomically characterized by rich in rough small white nodules without round in shape in diagnosis.The microscopic observation revealed that the nodules are the atypically stratified granuloma in structure without obvious boundaries between the necrosis tissues and healthy tissues.It appears that the nodules are obviously a huge“sarcoma”due to the large and obvious cell proliferation in the tissue of severe lesions.The RLO are bluish violet,spherical or particles and clustered,and observed in the lesion in tissue imprint stained by Giemsa-Wright,especially in the macrophages of spleen and kidney.The findings can provide evidence for pathologic diagnosis of the disease of rickettsia-like organism in tilapia.

rickettsia-like organism;tilapia;histopathology;tissue imprint;Giemsa-Wright staining

S941.42+9

A

1005-3832（2016）03-0021-04

2016-03-05

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD17B01）.

戚瑞榮（1986-），女，碩士研究生，從事水產(chǎn)動物疾病研究.E-mail:qrr1177@163.com