侯建勛，申世鉉

1 深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測中心），深圳市，518057

2 韓國高麗大學機械工學系，首爾市，136713，韓國

基于微流控和機器視覺的紅細胞變形性測量系統(tǒng)

【作 者】侯建勛1*，申世鉉2

1 深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測中心），深圳市，518057

2 韓國高麗大學機械工學系，首爾市，136713，韓國

紅細胞變形性主要取決于其細胞膜和細胞質(zhì)的組成成分，包括血紅素及其他成份?，F(xiàn)行大部分紅細胞變形性測量裝置在測試后均需清洗過程，浪費人力和時間。該文介紹了一種基于微流控和機器視覺的紅細胞變形性測量系統(tǒng)，其采用一次性可拋型微流控測試通道和傳統(tǒng)的激光衍射法。為了驗證該系統(tǒng)的準確性和重復性，分別用該系統(tǒng)（RSD）和已成功商用的類似系統(tǒng)（LORCA）對同一健康血樣進行紅細胞變形性測試，兩者測得的紅細胞變形性評價指數(shù)（拉伸系數(shù)EI）呈現(xiàn)出很好的一致性。

紅細胞；變形性；微流控；機器視覺

0 引言

紅細胞的變形性是指紅細胞在外力作用下改變自身形狀的能力，其主要取決于紅細胞的幾何結(jié)構(gòu)、細胞膜和內(nèi)液組成等因素，是直接影響血液循環(huán)尤其是微循環(huán)的重要因素之一，是血液流變學中重要的研究對象。多項研究表明，紅細胞變形性的降低與多種循環(huán)系統(tǒng)疾病存在著重要的聯(lián)系，如動脈硬化[1]、血栓癥[1]、糖尿病[2]、高血壓[3]以及貧血[4]等。因此，測量和研究紅細胞的變形性對于預防醫(yī)學和臨床醫(yī)學具有重要的意義和價值。

迄今為止，紅細胞變形性的測量方法主要有：粘性測量法、激光衍射法、微管吸吮法、電導法等，其中激光衍射法為目前采用較廣泛、研究最多的方法[5-7]，并已有成功商用機型，如LoRca(荷蘭R&R公司)和RHeoDYN SSD(德國Myrenne公司)。本文所述紅細胞變形性測量系統(tǒng)也是基于激光衍射法，其基本方法驗證及更多實驗研究可參見我們較早發(fā)表的論文[8]，本文主要就利用Labview和NI vision改進的基于微流控和機器視覺的測量系統(tǒng)RSD及其方法予以說明。

1 方法

1.1 系統(tǒng)原理

本文所述紅細胞變形性測量系統(tǒng)(以下簡稱RSD)的主要組成部件為：激光二極管(波長635 nm，功率1.5 mW)、ccD攝像頭、衍射投影屏、壓力傳感器、負壓裝置以及微流控測量通道(以下簡稱微通道，由透明聚苯乙烯材料通過微注塑成型)等，如圖1所示。測試液為靜脈血紅細胞由5.5%的PVP磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液稀釋至比積（Hct）0.5%所獲得的紅細胞懸浮液，該比積為現(xiàn)有方法試驗條件下，最大限度降低血樣量并保證準確度的最優(yōu)試驗值[5]。測試開始前，將500 μL的測試液置于微通道左側(cè)的進液腔；測試開始時，與微通道右側(cè)廢液腔由電磁閥相連的負壓裝置將產(chǎn)生負壓，電磁閥打開，由此產(chǎn)生的壓差將使測試液流過微通道(長：40 mm，寬：4 mm，高：200 μm)。隨著測試液不斷流向廢液腔，微通道兩側(cè)的壓差逐漸減小直至測試液停滯流動，壓力傳感器將實時記錄該壓差，其間，激光二極管(635 nm，1.5 mW)產(chǎn)生的激光穿過微通道中剪切流動的紅細胞，由此產(chǎn)生的衍射光斑投影到衍射投影屏并由ccD攝像頭實時采集。

圖1 RSD測量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成圖Fig.1 The schematic of RSD system

如圖2所示，微通道中測試液所承受剪切力呈指數(shù)減小。測試開始時，剪切力較高，微通道內(nèi)紅細胞拉伸程度較大，其衍射光斑呈扁長橢圓狀；測試中，隨著剪切力的減小，微通道內(nèi)紅細胞拉伸程度降低，衍射光斑逐漸趨于圓形；測試結(jié)束時，剪切力已近消失，微通道內(nèi)紅細胞基本無拉伸，衍射光斑近似圓形。本方法中用來作為評價紅細胞變形性的變形指數(shù)eI（elongation Index）與LoRca（荷蘭R&R公司）所采用參數(shù)基本一致，已為業(yè)界廣泛接受，且可由下式定義：

將衍射光斑視為橢圓，式中A和B分別為橢圓長軸和短軸的長度。基于Labview和NI Vision的實時數(shù)據(jù)采集和圖像處理程序可得出A和B并計算變形指數(shù)EI，因EI為無量綱參數(shù)，本方法所采用機器視覺圖像采集和處理過程中可省略校準，全程共耗時約30 s。

1.2 數(shù)據(jù)處理

由上可見，整個測試過程得到的是沿同一時間軸實時變化的一組壓力數(shù)據(jù)和一組衍射光斑圖像。壓力數(shù)據(jù)是指廢液腔（由膠塞密封且經(jīng)由電磁閥與負壓裝置可控相通）與進液腔（與大氣相通）間的壓差，由壓力傳感器實時測量采集，測得數(shù)據(jù)經(jīng)計算可得出微通道內(nèi)測試液所承受的平均剪切力。該計算過程可自編程后在Labview中調(diào)用code Interface Node來實現(xiàn)，基于現(xiàn)行設(shè)計，微通道中剪切力范圍為0～30 Pa。

圖2 紅細胞變形衍射光斑Fig.2 Diffraction patterns of RSD

圖3 橢圓擬合及邊界點獲取過程圖Fig.3 operation for ellipse ftting and boundary points catching

圖4 RSD測量系統(tǒng)控制軟件用戶界面Fig.4 User interface of RSD program

衍射光斑圖像在剪切力較高時呈現(xiàn)扁長橢圓形，隨著剪切力的逐漸降低而趨于圓形，其圖像處理基于NI Vision模塊提供的各種圖像處理函數(shù)，主要有以下三個過程：首先，利用clamp函數(shù)從水平和垂直兩個方向上獲取橢圓邊界點，見圖3；其次，將這些邊界點輸入到ellipse fitting函數(shù)中進行橢圓擬合，并得到擬合所得橢圓的長短軸數(shù)據(jù)；最后，利用前面所述公式計算EI。以上過程均可由Labview模塊化編程自動完成，并經(jīng)由用戶界面顯示數(shù)據(jù)、繪制圖線、打印結(jié)果，見圖4。

表1 同一血樣通過RSD和LoRca測得eI平均值的對比分析*Tab.1 Mean values of eI for normal red blood cells measured with RSD and LoRca*

2 對比及結(jié)論

為了驗證本系統(tǒng)的準確性，同一靜脈血樣同時在RSD和LoRca上進行了紅細胞變形性測試，其結(jié)果見圖5。兩臺設(shè)備測試方法均基于激光衍射法，數(shù)據(jù)處理算法和系統(tǒng)結(jié)構(gòu)存在顯著不同，但測試結(jié)果卻十分吻合。此外，為進一步驗證本系統(tǒng)的重復性，同一靜脈血樣在RSD和LoRca上分別進行了10次紅細胞變形性測試，并對所得EI平均值進行對比分析，結(jié)果見表1?？梢妰膳_設(shè)備上獲得的測試數(shù)據(jù)十分接近，隨著剪切力的增加，EI平均值的變異系數(shù)CV值均呈下降趨勢，且從剪切力大于1 Pa開始，兩組數(shù)據(jù)的相對誤差在2.7%以內(nèi)?；诩す庋苌浞ㄔO(shè)計的紅細胞變形性測試裝置廣泛采用剪切力為3 Pa時的EI值為評價紅細胞變形性的關(guān)鍵指標，RSD和LoRca的測試結(jié)果在此指標位置分別為0.296和0.298（見表1），相對偏差在1%以內(nèi)，十分接近。

圖5 同一血樣基于RSD與LoRca測試結(jié)果的對比Fig.5 comparison of EI for normal sample measured with RSD and LoRca

基于以上對比，可見RSD與已成功商用機型LoRca的表現(xiàn)十分相近，具有很好的一致性、準確性和重復性。而其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：①與LoRca所采用的杯狀固定測試容器相比，RSD采用由透明聚苯乙烯材料通過微注塑成型的一次性可拋微流控測試通道，價格低廉，測試完畢可直接作為醫(yī)用廢棄物處理，不需要清洗，避免樣品交叉干擾，并減少測試人員勞動強度，提高工作效率；②一次測試僅需不到5 μL血樣，可使用血糖儀一次性采血針獲得，樣品準備過程操作簡單，且一次測試耗時在30 s以內(nèi)；③機型結(jié)構(gòu)相對簡單，造價成本相對較低，有助于紅細胞變形性即時檢驗（PocT）走進中小醫(yī)療機構(gòu)，在糖尿病、心腦血管疾病診斷方面發(fā)揮作用。

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The Erythrocyte Deformability Measuring System Based on Microfuidic and Machine Vision

【 Writers 】HOU Jianxun1, SHIN Sehyun2
1 Shenzhen Institue for Drug Control (Shenzhen Testing Center of Medical Devices), Shenzhen, 518057
2 School of Mechanical Engineering, Korea University, Seoul, 136713, Korea

erythrocyte, deformability, microfuidic, machine vision

R 318.11

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.03.005

1671-7104(2016)03-0173-03

2016-02-19

侯建勛，博士，e-mail: houhit@qq.com

【 Abstract 】The erythrocyte deformability mainly depends on the composition of the membrane and cytoplasm, which consist of hemoglobin and other constituents. The most of current devices to measure erythrocyte deformability require washing process after the measurement which is labor-intensive and time-consuming. This article introduces an improved measuring system based on microfuidic and machine vision (RSD) which adopts disposable microfuidic channel and conventional laser-diffraction technique to determine erythrocyte deformability. To validate the accuracy and repeatability of RSD, several experiments are conducted to determine deformability of normal erythrocytes measured by RSD and a conventional ektacytometer(LORCA). The measured Elongation Index (EI) by RSD, which is a parameter directly related to erythrocyte deformability, is in excellent agreement with it measured by LORCA.