郭曉強(qiáng)

深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035

蛋白質(zhì)泛素化發(fā)現(xiàn)者
——羅斯

郭曉強(qiáng)?

深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035

羅斯；蛋白質(zhì)泛素化；酶學(xué)；諾貝爾化學(xué)獎

蛋白質(zhì)既是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)(靜態(tài)功能)，又是生命活動的體現(xiàn)者(動態(tài)功能)，因此蛋白質(zhì)的正常功能是生命得以維持的基本保證。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量有一個動態(tài)變化的過程以適應(yīng)不同環(huán)境的需求。過多造成浪費(fèi)，過少則影響生理功能，因此蛋白質(zhì)含量的精確調(diào)控對生命而言具有重要意義。蛋白質(zhì)含量由合成速度與降解速度間的平衡決定。蛋白質(zhì)合成由mRNA負(fù)責(zé)翻譯，而蛋白質(zhì)降解過程長期以來認(rèn)為由溶酶體負(fù)責(zé)，直到1980年泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)才改觀了人們的認(rèn)識。三位做出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家也因此分享了2004年諾貝爾化學(xué)獎，其中之一是美國生物化學(xué)家羅斯(Irwin Allan Rose)(圖1)[1]。

熱愛科學(xué)

1926年7月16日，羅斯出生于紐約布魯克林的一個猶太家庭。父親哈利(Harry Royze Rose)經(jīng)營一家裝飾公司。13歲時，由于弟弟患有風(fēng)濕熱，母親帶著羅斯和弟弟搬到相對干燥的華盛頓州斯波坎(Spokane)的親戚家居住，而父親繼續(xù)在紐約打理生意。羅斯曾在斯波坎當(dāng)?shù)匾患裔t(yī)院的精神科病房擔(dān)任助理，并因此對大腦產(chǎn)生癡迷，進(jìn)而對醫(yī)學(xué)充滿極大興趣。盡管羅斯父母和親戚都很少從事研究工作，但羅斯還是將科學(xué)作為自己的未來職業(yè)。進(jìn)入華盛頓州立大學(xué)后，羅斯失望地發(fā)現(xiàn)學(xué)校并沒有神經(jīng)生物學(xué)課程，無奈之下只好選擇動物學(xué)作為專業(yè)。

由于第二次世界大戰(zhàn)，羅斯在入學(xué)一年后開始到海軍服役，擔(dān)任無線電技術(shù)人員。退役后，羅斯進(jìn)入芝加哥大學(xué)學(xué)習(xí)，并于1948年獲得學(xué)士學(xué)位，隨后繼續(xù)進(jìn)行博士研究。羅斯的博士研究課題是試圖測量維生素B12對大鼠組織DNA含量的影響。這項(xiàng)計(jì)劃注定是失敗的，因?yàn)镈NA遺傳信息載體的功能已經(jīng)闡述，每個組織中DNA含量都相對恒定，不依賴于飲食情況而發(fā)生明顯變化。在這個項(xiàng)目不順的情況下，羅斯匆忙找到一個替代課題——研究胞苷和核糖在脫氧胞苷合成中的作用。羅斯承認(rèn)對這個項(xiàng)目缺乏興趣，而只是為了畢業(yè)的權(quán)宜之計(jì)，但在研究過程中，羅斯逐漸對酶產(chǎn)生了濃厚興趣。1952年，羅斯從芝加哥大學(xué)獲得博士學(xué)位，并選擇進(jìn)一步研究酶的催化機(jī)制[2]。

酶學(xué)專家

20世紀(jì)50年代，正是生命科學(xué)變革的一個重要節(jié)點(diǎn)。1953年，DNA雙螺旋模型的提出使許多科學(xué)家加入分子生物學(xué)這一新興領(lǐng)域，核酸研究也迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的主流，但經(jīng)典酶學(xué)仍是一個重要方向。當(dāng)時，代謝通路大多已經(jīng)闡明，羅斯選擇深入探索酶催化的詳細(xì)分子機(jī)制作為研究方向。在經(jīng)歷西儲大學(xué)(Case Western Reserve University)卡特(Charles Carter)教授和紐約大學(xué)著名酶學(xué)大師奧喬亞(Severo Ochoa，1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)教授的博士后訓(xùn)練后，羅斯于1954年成為耶魯大學(xué)藥學(xué)院的一位生物化學(xué)講師，并開始獨(dú)立的科研生涯。1963年，羅斯離開耶魯大學(xué)加入位于賓夕法尼亞州費(fèi)城的法克斯蔡司癌癥研究中心(Fox Chase Cancer Center)。這個研究中心的目的是在更寬廣的層面上理解癌癥發(fā)生的原因。羅斯被這種自由和多學(xué)科交叉的研究氛圍所吸引而加入該研究所，并一直工作到退休。

從耶魯大學(xué)開始，羅斯的研究重點(diǎn)就在酶的催化機(jī)制，這也是他一生的主要研究內(nèi)容。羅斯先驅(qū)性地將同位素示蹤、立體化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和同位素捕獲等理論和技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來用于研究酶催化反應(yīng)的詳細(xì)過程，從而可以在前人難以企及的精細(xì)水平上探索質(zhì)子轉(zhuǎn)移。通過體外測量酶促反應(yīng)過程中質(zhì)子與溶劑、底物或產(chǎn)物間的交換/轉(zhuǎn)移過程，羅斯可在不知酶結(jié)構(gòu)的前提下詳細(xì)描述酶的具體機(jī)制。他還進(jìn)一步與晶體學(xué)家、光譜學(xué)家和化學(xué)家等合作，從而對化學(xué)反應(yīng)的細(xì)節(jié)了解得更為清晰。羅斯和同事先后清晰闡明糖酵解和三羧酸循環(huán)過程中多種酶的催化機(jī)制，包括醛縮酶、丙糖/戊糖異構(gòu)酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶等。憑借這一系列成就，羅斯成為領(lǐng)域內(nèi)著名的酶學(xué)大師，并于1978年當(dāng)選為美國科學(xué)院院士[3]。羅斯不僅在代謝酶領(lǐng)域取得巨大成功，而且對蛋白質(zhì)降解機(jī)制亦情有獨(dú)鐘。

蛋白質(zhì)降解

早在1953年，辛普森(Melvin Simpson)就開始研究蛋白質(zhì)降解的機(jī)制。他以肝臟切片為材料研究同位素標(biāo)記的蛋氨酸從蛋白質(zhì)中釋放的情況(速度快慢反映蛋白質(zhì)分解)。當(dāng)在低氧環(huán)境或用氰化物/2,4-二硝基苯酚處理后發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解速度顯著降低。由于這些處理都可造成ATP生成的減少，因此推測ATP對蛋白質(zhì)降解發(fā)揮著重要作用。1954年羅斯進(jìn)入耶魯大學(xué)生物系后，成為了辛普森的同事，并且兩人的實(shí)驗(yàn)室相隔不遠(yuǎn)，因此他有機(jī)會了解辛普森的研究內(nèi)容。盡管辛普森不久轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)體外合成系統(tǒng)而放棄進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)降解，羅斯卻對蛋白質(zhì)降解的問題特別癡迷，并一直念念不忘，想解開這個謎題。

在耶魯期間，羅斯并未進(jìn)行蛋白質(zhì)降解的研究。來到費(fèi)城后，他開始逐漸做一些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)以尋找蛋白質(zhì)分解相關(guān)因子，但由于一直未獲得理想的實(shí)驗(yàn)體系而進(jìn)展緩慢，羅斯也一直未發(fā)表任何一篇與蛋白質(zhì)分解相關(guān)的論文。20世紀(jì)70年代初，ATP依賴的蛋白質(zhì)降解一直未取得真正意義上的突破。詳細(xì)過程是一個無人知曉的黑箱子，而轉(zhuǎn)機(jī)來自于一次學(xué)術(shù)會議。

1975年，在美國貝塞斯達(dá)舉辦的福格蒂表達(dá)調(diào)控會議(Fogerty Conference on Regulation)上，羅斯結(jié)識了來自以色列的科學(xué)家赫什科(Avram Hershko)，從而開啟一段科研合作的佳話。赫什科曾在美國加州大學(xué)舊金山分校進(jìn)行博士后研究，對ATP依賴的蛋白質(zhì)降解過程也充滿極大興趣，并打算在美國尋找一家實(shí)驗(yàn)室合作研究。遺憾的是，他的博士后指導(dǎo)老師意外去世，從而使赫什科不得不尋找新的合作伙伴。與羅斯的交流使赫什科感到很適合開展學(xué)術(shù)合作，并因此達(dá)成協(xié)議，每年的學(xué)術(shù)休假和夏季來到羅斯實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1977年，赫什科和他的博士切哈諾沃(Aaron Ciechanover)等人來到費(fèi)城，全面啟動蛋白質(zhì)降解研究計(jì)劃，并且形成一個老中青三代配置的核心團(tuán)體。當(dāng)時羅斯51歲，赫什科40歲，而切哈諾沃30歲，因此，這個團(tuán)隊(duì)中羅斯主要發(fā)揮顧問作用(憑借自己在酶學(xué)研究方面的深厚基礎(chǔ)為課題的實(shí)施提出指導(dǎo)性意見)，赫什科更多是項(xiàng)目負(fù)責(zé)人角色(主要負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的工作)，而切哈諾沃則是課題的主要實(shí)施者(核心實(shí)驗(yàn)基本由他完成)。此外還有多名研究人員參與，羅斯的三位博士后威爾金森(Keith Wilkinson)、哈斯(Arthur Haas)和皮卡特(Cecile Pickart)等亦發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

成功合作

當(dāng)時已知的細(xì)胞內(nèi)降解途徑是在溶酶體完成，并由相應(yīng)蛋白酶催化。1977年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的戈德堡(Alfred L. Goldberg)和同事選擇缺乏溶酶體的網(wǎng)狀紅細(xì)胞成功制備出細(xì)胞裂解液，并研究發(fā)現(xiàn)這個系統(tǒng)仍可降解蛋白質(zhì)，同時需要ATP參與，而且蛋白質(zhì)降解過程最適pH值偏堿性(7.8)，從而進(jìn)一步否定溶酶體蛋白酶釋放的可能(酸性催化)[4]。這個結(jié)果進(jìn)一步說明，細(xì)胞內(nèi)確實(shí)存在一個不依賴溶酶體，但依賴ATP的蛋白降解體系。這個突破立刻引起赫什科注意，并決定利用這個理想研究體系進(jìn)一步解析蛋白質(zhì)降解的詳細(xì)機(jī)制。

為避免內(nèi)源蛋白對外加蛋白的干擾，赫什科和切哈諾沃決定先去除紅細(xì)胞裂解液含量極為豐富的血紅蛋白。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，他們利用離子交換樹脂對裂解液進(jìn)行分離，從而將裂解液分成兩部分：不被樹脂吸附的部分和被樹脂吸附后又被高鹽洗脫的部分。隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩部分單獨(dú)情況下均無蛋白質(zhì)降解活性，但二者混合后具有這種活性?？紤]到不被樹脂吸附的部分成分較少，因此他們決定先從中分離活性成分，并最終發(fā)現(xiàn)一種小分子熱穩(wěn)定性蛋白，命名為APF-1 (active principle in fraction 1)[5]。

至此，所有研究都在按部就班進(jìn)行。按照赫什科推測，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)存在一類獨(dú)立于溶酶體之外且依賴ATP的蛋白酶，這類蛋白酶應(yīng)有兩部分組成——酶蛋白(大分子)和輔酶(小分子)，因此推測APF-1可能發(fā)揮輔酶的功能。為更好研究蛋白酶作用機(jī)制，赫什科團(tuán)隊(duì)聯(lián)合羅斯團(tuán)隊(duì)深入探索兩種組分的詳細(xì)作用。

羅斯再一次發(fā)揮了自己在酶學(xué)研究方面的雄厚知識背景和熟練操作能力。他指導(dǎo)研究生先將APF-1和待降解蛋白質(zhì)(如溶菌酶和乳白蛋白)分別標(biāo)記同位素I-125，然后將它們分別與紅細(xì)胞裂解液混合，完畢后借助電泳和放射自顯影方法檢測標(biāo)記同位素蛋白質(zhì)的變化情況。結(jié)果取得意想不到的發(fā)現(xiàn)。首先，檢測標(biāo)記同位素APF-1時，發(fā)現(xiàn)分子量顯著增加，意味著它應(yīng)與其他蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)了結(jié)合，而且蛋白質(zhì)變性后二者還可緊密結(jié)合，說明APF-1與蛋白質(zhì)間形成共價鍵[6]；其次，檢測待降解蛋白質(zhì)放射性時，發(fā)現(xiàn)有多個條帶，暗示同一種蛋白質(zhì)可結(jié)合多個APF-1分子[7]；最后，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在一定情況下APF-1與蛋白質(zhì)可以分開，因此二者的結(jié)合是一個可逆過程。在簡單生化分析的基礎(chǔ)上，羅斯提出一個蛋白質(zhì)被APF-1修飾的機(jī)制模型(圖1)，而后續(xù)研究證實(shí)這個模型給出的解釋與預(yù)測驚人地吻合[8]。

與此同時，羅斯團(tuán)隊(duì)取得另一重大突破。博士后威爾金森和哈斯與隔壁實(shí)驗(yàn)室研究人員較為熟悉。在一次談話中，威爾金森提及是否存在兩種蛋白質(zhì)之間的共價結(jié)合，而隔壁實(shí)驗(yàn)室的一名博士后突然想起最近才發(fā)表的一項(xiàng)工作，就是組蛋白H2A可與泛素之間形成共價鍵。這一消息激發(fā)了兩位博士后的靈感。他們立刻啟動試驗(yàn)，并不久證實(shí)APF-1和泛素就是同一物質(zhì)[9]。至此，蛋白質(zhì)泛素化修飾被正式發(fā)現(xiàn)。這個進(jìn)展一方面闡明了一種細(xì)胞內(nèi)全新的蛋白質(zhì)降解機(jī)制，另一方面還有效地解釋了一個科學(xué)難題。因?yàn)殡逆I水解在熱力學(xué)上是一個放熱反應(yīng)，沒有ATP輔助的必要，而羅斯他們的結(jié)果表明ATP消耗在泛素修飾階段，因此并不違背熱力學(xué)。

這一突破性的發(fā)現(xiàn)一方面奠定了羅斯等在蛋白質(zhì)泛素化研究領(lǐng)域的地位，也成為將來授予諾貝爾獎的主要依據(jù)；另一方面也完全改變了研究小組的科研方向，從當(dāng)初試圖尋找一類ATP依賴的蛋白酶轉(zhuǎn)向研究蛋白質(zhì)的泛素修飾過程。1981年到1983年，他們?nèi)骊U明了蛋白質(zhì)泛素化修飾的三個階段。切哈諾沃和赫什科充分發(fā)揮酶分離方面的優(yōu)勢，鑒定出泛素化過程的三類酶，即泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)，其中E3種類最為豐富，它決定靶蛋白泛素修飾特異性；而羅斯憑借在酶研究方面嫻熟的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在皮卡特協(xié)助下全面開展了對泛素修飾相關(guān)酶作用機(jī)制的探索[10]，包括ATP/ PPi交換實(shí)驗(yàn)、E1酶共價層析純化、巰基中間產(chǎn)物的闡明和去泛素化酶的鑒定等。后來，其他科學(xué)家鑒定出26S蛋白酶體，從而擴(kuò)展了蛋白質(zhì)泛素化-蛋白酶體降解體系：蛋白質(zhì)可在三類泛素修飾酶催化下發(fā)生多泛素化；而多泛素化是啟動蛋白質(zhì)降解的死亡標(biāo)記，因此泛素被稱為死亡標(biāo)簽；多泛素化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)入蛋白酶體被降解，釋放出的泛素可進(jìn)一步被重復(fù)利用(圖2)。至此，表明在溶酶體外還存在蛋白酶體這一重要蛋白降解細(xì)胞器。

隨著蛋白質(zhì)泛素化在多個生理過程(如細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)和免疫防御等)中重要性的發(fā)現(xiàn)，三位科學(xué)家羅斯、切哈諾沃和赫什科憑借“泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的發(fā)現(xiàn)”而分享2004年諾貝爾化學(xué)獎[11]。蛋白質(zhì)泛素化異常還被發(fā)現(xiàn)與多種疾病包括癌癥和囊性纖維化變性等相關(guān)，從而為疾病治療提供新方向?？茖W(xué)家通過研發(fā)藥物干擾蛋白降解或促進(jìn)致病蛋白降解而實(shí)現(xiàn)疾病治療的目的。用于多發(fā)性骨髓瘤治療的藥物萬珂(Velcade)就是一種蛋白酶體抑制劑。

蛋白質(zhì)泛素化修飾發(fā)現(xiàn)背后的驅(qū)動力僅僅在于想回答一個基本的科學(xué)問題，研究人員也完全出于一種科學(xué)激情。當(dāng)時極少人能理解這項(xiàng)工作的重要性，因此也無法預(yù)見將來可獲得諾貝爾獎。這也充分體現(xiàn)科學(xué)研究本身的不可預(yù)見性。另外，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)還闡明一個科學(xué)研究的普遍規(guī)律：任何生命現(xiàn)象的第一次被闡明都是極其困難的，我們更喜歡依賴已有經(jīng)驗(yàn)和知識提出合乎常規(guī)的假說，但真正具有獨(dú)特性和新穎性的概念往往被忽視許多年。

圖1 羅斯和他提出的蛋白質(zhì)泛素化模型

圖2 蛋白質(zhì)泛素化-蛋白酶體降解示意圖

晚年科研

1995年，羅斯退休回到加州的拉古納伍茨(Laguna Woods)，但對科學(xué)的摯愛使他不愿在家頤養(yǎng)天年，而是繼續(xù)工作。他又加入加州大學(xué)歐文分校生理學(xué)與生物物理學(xué)系研究三羧酸循環(huán)過程中一個重要酶——延胡索酸酶的作用機(jī)制。羅斯在加州的工作很有規(guī)律，一周3～4天在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室，一年發(fā)表一篇研究論文。

在同事的眼中，羅斯是一個純粹的、近乎完美的科學(xué)家。面對科學(xué)，羅斯表現(xiàn)出謙遜和無休止的好奇心；面對同事和后輩，羅斯表現(xiàn)更多的是慷慨和無私。羅斯關(guān)注更多的是科學(xué)本身，而非因發(fā)現(xiàn)本身帶來的榮譽(yù)。諾貝爾化學(xué)獎宣布當(dāng)晚，羅斯還正在口袋中夾著兩支試管，悄悄來到另一位諾貝爾獎獲得者萊因斯的實(shí)驗(yàn)室，利用大學(xué)公用的質(zhì)譜儀器分析實(shí)驗(yàn)樣品?；瘜W(xué)教授諾瓦克(James Nowick)對羅斯的評價是：永不滿足于自己已經(jīng)取得的成就，總是渴望取得新的發(fā)現(xiàn)。羅斯非常喜歡為那些陷于困境的年輕學(xué)子或博士后提供援手，還非常樂意與年輕人一起探索自然奧秘，鼓勵他們選擇“瓶頸”問題作為研究方向。在赫什科看來，羅斯的科學(xué)貢獻(xiàn)遠(yuǎn)非僅僅通過文章可以體現(xiàn)的，因?yàn)樵S多情況下，羅斯不愿署名，而愿把更多機(jī)會給予年輕人[12]。羅斯在蛋白質(zhì)泛素化發(fā)現(xiàn)過程中具有不可替代的作用。以兩篇《美國科學(xué)院院刊》(PNAS)經(jīng)典論文為例。由于羅斯已是美國科學(xué)院院士，因此具有發(fā)表文章的“特權(quán)”。盡管赫什科那篇論文未署羅斯的姓名，但也由羅斯推薦(羅斯強(qiáng)烈要求不署自己的姓名)。另外，發(fā)現(xiàn)APF-1和泛素為同一分子的文章，羅斯也未曾署名，而是只有博士后的名字。

2015年6月2日，羅斯在馬薩諸塞州迪爾菲爾德(Deerfield)于睡眠中離世，享年88歲。多個著名雜志都刊發(fā)訃告[3,12-13]，以紀(jì)念這位偉大而低調(diào)的化學(xué)家。本文一方面緬懷這位科學(xué)大師，另一方面也展示蛋白質(zhì)泛素化發(fā)現(xiàn)背后的科學(xué)故事。

(2015年10月26日收稿)■

[1] 郭曉強(qiáng). 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解—2004年諾貝爾化學(xué)獎[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2004, 39(11): 22-23.

[2] ROSE I A. Isotopic strategies for the study of enzymes [J]. Protein Sci, 1995, 4(7): 1430-1433.

[3] HAAS A L, WILKINSON K. Irwin (Ernie) Allen Rose (1926—2015) [J]. Cell, 2015, 162(2): 235-236.

[4] GOLDBERG A L. Nobel committee tags ubiquitin for distinction [J]. Neuron, 2005, 45(3): 339-344.

[5] KRESGE N, SIMONI R D, HILL R L. The discovery of ubiquitin-mediated proteolysis by Aaron Ciechanover, Avram Hershko, and Irwin Rose [J]. J Biol Chem, 2006, 40(281): e32.

[6] CIECHANOVER A, HELLER H, ELIAS S, et al. ATP-dependent conjugation of reticulocyte proteins with the polypeptide required for protein degradation [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(3): 1365-1368.

[7] HERSHKO A, CIECHANOVER A, HELLER H, et al. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of proteins with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(4): 1783-1786.

[8] ROSE I A. Ubiquitin at Fox Chase [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(33): 11575-11577.

[9] WILKINSON K D. The discovery of ubiquitin-dependent proteolysis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(43): 15280-15282.

[10] IRWIN R. Early work on the ubiquitin proteasome system, an interview with Irwin Rose. Interview by CDD [J]. Cell Death Differ, 2005, 12(9): 1162-1166.

[11] WILKINSON K D. Ubiquitin: a Nobel protein [J]. Cell, 2004, 119(6): 741-775.

[12] WILKINSON K, HERSHKO A. Irwin Allan Rose (1926—2015) [J]. Nature, 2015, 523(7562): 532.

[13] KLINMAN J P. Irwin Rose (1926—2015) [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(34): 10568-10569.

(編輯：沈美芳)

The discoverer of protein ubiquitination: Irwin Allan Rose

GUO Xiaoqiang
Shenzhen Second People's Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

Irwin Allan Rose, protein ubiquitination, enzyme, Nobel Prize in Chemistry

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.03.010

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