文/ Guido Duessing

DBS干血點(diǎn)檢測(cè)分析

文/ Guido Duessing

簡(jiǎn)單又可靠的自動(dòng)化血液樣本制備

在對(duì)血液的檢測(cè)分析中，精確度、靈敏度、樣本量和檢測(cè)時(shí)間等因素都是考察一種方法適用性時(shí)需要考慮的。在上述所有方面，干血點(diǎn)分析技術(shù)得分都是最高的。

早在100多年前，臨床化學(xué)領(lǐng)域先驅(qū)者——Ivan Christian Bang先生，就發(fā)明了可以從幾滴血中找到有價(jià)值信息的方法了，它就是DBS干血點(diǎn)分析法，此法更嚴(yán)謹(jǐn)，更加容易被廣泛應(yīng)用。具體時(shí)間可以追溯到上世紀(jì)60年代，被用于新生兒代謝性疾病的診斷分析中。隨著時(shí)間的推移，尤其是在高性能的LC/MS和GC/MS系統(tǒng)幫助下，干血點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍又有了進(jìn)一步的拓展。在多種DBS干血點(diǎn)檢測(cè)分析應(yīng)用中，一直都有很多新領(lǐng)域的應(yīng)用研發(fā)，例如在藥物研究中的應(yīng)用方法開(kāi)發(fā)、在臨床化學(xué)或治療藥物監(jiān)測(cè)中的研究，其中，在法醫(yī)毒物學(xué)的檢測(cè)分析、興奮劑的檢測(cè)分析中，干血點(diǎn)檢測(cè)法也有著大量的應(yīng)用。

圖1.DBS干血點(diǎn)纖維素卡流動(dòng)解吸（脫附）原理圖。

簡(jiǎn)單而又可靠的樣本制備

DBS干血點(diǎn)檢測(cè)分析技術(shù)中，微量樣本的制備明顯“刺痛”了其他可用技術(shù)方法，要知道，僅僅從手指肚或者腳后跟取幾滴血就足以完成DBS干血點(diǎn)檢驗(yàn)了。使用時(shí)、儲(chǔ)存時(shí)、分析時(shí)，血液樣本只需放在作為樣本載體的特殊纖維素卡片上就可以了，已使用的以及正在開(kāi)發(fā)的樣本載體材料也不僅僅只有這一種，例如聚合物載體材料，還有滿足特殊功能要求，能夠提供了蛋白質(zhì)檢測(cè)可能性的纖維素卡片。

手工將血液滴在載體材料圓形凹坑內(nèi)。所滴的血滴量應(yīng)保證能夠均勻分布在限定的范圍內(nèi)，值得注意的是，這些操作最好可以在取樣現(xiàn)場(chǎng)直接完成，這也是微量取樣的一個(gè)缺陷，因?yàn)橐坏窝苋菀撞恍⌒母傻簟Ｈ雍篑R上放到檢測(cè)儀中進(jìn)行分析，或者制成干血樣本特殊通過(guò)特殊保存方式郵寄到較遠(yuǎn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析?？傊珼BS干血點(diǎn)檢測(cè)法提供了最簡(jiǎn)單的樣本制備，節(jié)約時(shí)間的同時(shí)也為用戶提供了最高的使用靈活性。

分析領(lǐng)域更廣闊

在傳統(tǒng)的手工樣本制備的框架內(nèi)，由于血滴成分分布的均勻性，使得通過(guò)沖壓加工可以得到特定的直徑，從而能夠容納規(guī)定容積的血液樣本，干血樣本的制備使得對(duì)規(guī)定量血液進(jìn)行檢驗(yàn)成為可能。一滴干血樣相當(dāng)于15～30 μl的新鮮血液，例如沖壓直徑3 mm的圓形凹坑相當(dāng)于1～2 μl的血液。用合適的稀釋劑將卡片凹坑中的干血樣萃取到玻璃片或者微孔板中；樣本瓶在離心分離機(jī)中分離出檢測(cè)樣本，清理好多余的物質(zhì)；直接在完成稀釋劑交換之后馬上進(jìn)行檢測(cè)分析，最常用的檢測(cè)分析方法是LC-MS/MS分析法或者GC-MS/MS多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)法。也可以與免疫分析、PCR聚合酶鏈反應(yīng)、ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜和LC液相分析等檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用。相比之下，比以前手工操作能夠完成的樣本要多很多。

事實(shí)證明：DBS干血點(diǎn)分析是滿意度非常高的檢測(cè)方法，因?yàn)樗?jiǎn)單易操作，能給分析工作者帶來(lái)很多驚喜。魯爾市Gerstel公司的應(yīng)用技術(shù)專家Oliver Lerch博士強(qiáng)調(diào)說(shuō)：“DBS干血點(diǎn)檢測(cè)分析的自動(dòng)化會(huì)極大提高檢測(cè)分析的效率和分析能力，因?yàn)樽詣?dòng)化能夠提高樣本處理通量、簡(jiǎn)化常規(guī)分析步驟。盡管目前每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有著各種不同的自動(dòng)化解決方案，但DBC干血點(diǎn)的解吸與液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)之間的自動(dòng)化仍是最佳分析設(shè)計(jì)方案?！保ㄒ?jiàn)圖1）。值得一提的是，此系統(tǒng)是Gestel公司與荷蘭Spark公司合作研發(fā)并設(shè)計(jì)生產(chǎn)的，適合在制藥研究實(shí)驗(yàn)室和反興奮劑實(shí)驗(yàn)室中使用。

圖2.在Gerstel公司自動(dòng)進(jìn)樣器解吸后的DBS干血點(diǎn)纖維素卡片。

干血點(diǎn)分析

對(duì)干燥血斑中的物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)分析是藥物殘留分析中經(jīng)常采用的分析方法。在抽取血液中標(biāo)記的范圍內(nèi)，用一張專用試紙覆蓋干燥。手動(dòng)人工干血點(diǎn)分析是一項(xiàng)非常耗費(fèi)時(shí)間和人力的檢測(cè)工作，而MPS-DBS-SPExos-LC/M系統(tǒng)則為用戶提供了一種全自動(dòng)的成套解決方案。

自動(dòng)化提高了樣本處理通量

Lerch博士簡(jiǎn)單明確的介紹說(shuō)：“Gestel公司研發(fā)的MPS多用途采樣儀是基于與LC-MS/MS系統(tǒng)聯(lián)用基礎(chǔ)之上的干血點(diǎn)檢測(cè)整體解決方案。首先，MPS采樣儀將DBS干血樣纖維素卡片送至攝像機(jī)下；攝像機(jī)內(nèi)置圖像處理軟件探測(cè)干血點(diǎn)的位置，評(píng)判干血點(diǎn)的質(zhì)量；然后將纖維素卡片送到解吸接口處，合適的稀釋劑流經(jīng)解吸接口下的干血點(diǎn)（部分或者全部采樣），解吸分析物。根據(jù)需要，解吸劑可以按照內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)定量滴注，下一步的純化可以按照常規(guī)的在線洗脫方式，經(jīng)自動(dòng)切換，采用固相萃取專用SPE模塊（SPExos）完成。“與傳統(tǒng)的SPE固相萃取相比較，專用的SPExos可以實(shí)現(xiàn)只有15 mg甚至更小量的吸附，這使得實(shí)現(xiàn)微量化分析成為可能?！盠erch博士如此解釋，“所需的樣本、稀釋劑明顯更少，因此所消耗的功率和洗脫液容積也都更小了?！?/p>

Lerch博士表示，在使用LC的檢測(cè)分析中，系統(tǒng)完成檢測(cè)后，DBS干血點(diǎn)卡片被送出來(lái)，重新清洗干凈管道，為監(jiān)控整個(gè)操作過(guò)程，將在解吸步驟之后對(duì)干血點(diǎn)卡片解吸拍照存檔。由于整個(gè)系統(tǒng)可以直接與LC設(shè)備相互連接，因此對(duì)解吸范圍的檢測(cè)分析可以全部在液相色譜柱中進(jìn)行，這也就保證了很好的指示終點(diǎn)。MPS-DBSSPExos-LC/M系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用的測(cè)定

■■中到底是否適用？在一些法醫(yī)毒理學(xué)的重要分析任務(wù)中，它可以完成7-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因、美沙酮、苯甲酰和氨基氟硝西泮的檢測(cè)分析。

檢測(cè)時(shí)，在這些樣本上還用滴定管滴上了豬血——每個(gè)DBS干血點(diǎn)卡片上滴了20 μl的豬血。DBS自動(dòng)進(jìn)樣器中，干血點(diǎn)在水質(zhì)的乙腈/甲酸溶液作用下從纖維素卡上脫附下直徑大小6 mm樣本。脫附下來(lái)的血液樣本在SPExos模塊的混合型陽(yáng)離子交換劑盒中凈化。最后，分析物在甲醇/水/氨的溶劑的混合液中洗脫，在液相色譜柱中用含水甲酸稀釋、中和，最后的檢測(cè)分析是在三重四極桿質(zhì)譜儀中完成的。

本文作者系德文版LaborPraxis特約撰稿人。