江錦秀，林裕勝，游 偉，江 斌，胡奇林

（福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013）

山羊萊氏無膽甾原體FJ－NP株的分離鑒定

江錦秀，林裕勝，游 偉，江 斌，胡奇林＊

（福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013）

摘 要：為明確福建省某羊場發(fā)生的疑似羊支原體性肺炎病例的病原，利用支原體培養(yǎng)基對發(fā)病羊肺臟組織的病原進行分離培養(yǎng)和純化，通過生化試驗和特異性PCR方法進行鑒定，并對分離株16SrRNA進行測序分析。結果顯示，分離株菌落呈油煎蛋狀，有棕黃色中心突起；能發(fā)酵葡萄糖，不能水解精氨酸，不分解尿素，氯化四氮唑還原反應、膽固醇需要試驗、血細胞吸附試驗及溶血試驗的結果均為陰性，美蘭還原反應陽性。經PCR擴增出萊氏無膽甾原體支原體（Acholeplasmalaidlawii，AL）大小為505bp的特異性目的片段，分離株16SrRNA序列與萊氏無膽甾原體標準株PG8同源性為99.8%。鑒定結果表明，本次從山羊肺臟組織分離到的支原體為萊氏無膽甾原體，命名為FJ－NP株，但該分離株與山羊發(fā)病性的關系有待進一步研究。

關鍵詞：山羊支原體性肺炎；萊氏無膽甾原體；分離；鑒定

萊氏無膽甾原體（Acholeplasmalaidlawii，AL）屬于柔膜體綱，支原體目，無膽甾原體科，無膽甾原體屬。萊氏無膽甾原體最初分離自污水、肥料、腐土質、土壤和植物組織［1］，后來人們發(fā)現在牛生殖道和鼻腔、豬鼻腔、人口腔、雞竇等各種哺乳動物和鳥類中均發(fā)現其寄生現象。萊氏無膽甾原體也是常見的污染細胞的支原體之一［2－4］。1950年，Edward從牛生殖道中分離到萊氏無膽甾原體，首次證實了該支原體與動物宿主的相關性。2002年，權忠會等［5］從陜北患流行性陰道子宮內膜炎的驢生殖道分泌物中分離到一株萊氏無膽甾原體，該分離株與驢地方流行性陰道和子宮炎的關系需進一步確定。目前尚未見從羊肺臟中分離到萊氏無膽甾原體的報道。2014年福建省某山羊場疑似發(fā)生羊支原體性肺炎，為了明確病原，本研究對該養(yǎng)殖場疑似羊支原體性肺炎病例進行了支原體分離和鑒定，旨在為福建省羊支原體性肺炎和山羊傳染性胸膜肺炎的流行病學研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 疑似發(fā)生羊支原體性肺炎的病山羊1只（臨床見喘氣、咳嗽、流鼻涕、消瘦，剖檢見部分肺臟、肝臟病變），由福建省某發(fā)病羊場提供。

1.1.2主要試劑 PPLO肉湯（不含結晶紫）購自青島海博生物科技高科園；滅活馬血清、青霉素和酵母浸粉均購自上海銘睿生物科技有限公司；BACTOTM瓊脂購自美國BD公司；Premix Taq和DL2000DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；組織DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄萄、丙酮酸鈉和酚紅均購自國藥集團化學試劑公司。

1.2方法

1.2.1支原體培養(yǎng)基的配制 將Thiaucourt等［6］方法中的Hayflick’s培養(yǎng)基略作修改。成分：不含結晶紫的PPLO肉湯（21g／L）、酵母浸粉（1.5g／L）、葡萄糖（4g／L）、0.5%酚紅（3.2mL／L）、丙酮酸鈉（2g／L）、青霉素（20萬IU／L）。制法：將上述成分溶于800mL去離子水后高壓滅菌，固體培養(yǎng)基另加入Difco瓊脂10g，冷卻至50℃左右（血瓊脂平板中另外加入10%無菌綿羊脫纖維血），加入過濾的丙酮酸鈉（2g／L）、青霉素（20萬IU／L）及滅活馬血清（200mL／L），用1mol／L NaOH調pH至7.6～7.8，傾倒平皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2支原體的分離和純化 無菌取病料肺臟組織的病健交界處，加入適量培養(yǎng)液研磨，3 000r／min離心5min后取上清，用0.45μm過濾器過濾，加入PPLO液體培養(yǎng)，待培養(yǎng)物變色后再次過濾，倍比稀釋，接種于PPLO固體培養(yǎng)基，置于支原體培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)，經3次純化得到純培養(yǎng)物［7］。

1.2.3菌體形態(tài)觀察 取1mL變黃的液體培養(yǎng)基，用接種棒挑取液體，均勻涂布于載玻片上，用吉姆薩染色液染色，用蒸餾水沖洗干凈，待干鏡檢。

1.2.4L－型細菌的檢驗 將分離株接種到無抑菌劑的液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳10代，經染色鏡檢和固體培養(yǎng)，觀察分離株是否恢復成細菌形態(tài)［7］。

1.2.5生化鑒定 發(fā)酵葡萄糖、水解精氨酸和分解尿素試驗：參考文獻［8－12］將分離菌株分別接種于含10%葡萄糖、10%精氨酸及10%尿素的PPLO培養(yǎng)基中，設不接菌的對照管培養(yǎng)基作為對照管；膽固醇需要試驗：分離菌株在無血清的PPLO液體培養(yǎng)基中傳5代，同時設不接菌株的PPLO液體培養(yǎng)基作為對照管；美蘭還原試驗：在長出菌落的PPLO固體培養(yǎng)基表面加入等量的0.5mL／L美蘭和0.5%雞紅細胞，37℃放置30min，菌落上或周圍的紅細胞被著色為陽性，未著色為陰性；氯化四氮唑還原試驗：分離株接種于不含酚紅和葡萄糖，但含0.2g／L氯化三苯基四氮唑的PPLO液體培養(yǎng)基中，不接種菌株的為陰性對照管，接種菌株的培養(yǎng)基變成磚紅色或者紅色，而對照管不變色為陽性；血細胞吸附試驗：在長出菌落的PPLO固體培養(yǎng)基表面加入0.25%雞紅細胞，室溫放置20min，吸掉紅細胞，用生理鹽水洗滌，菌落表面布滿紅細胞者為陽性；溶血試驗：分離株接種于含10%綿羊脫纖維血的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，在菌落周圍出現綠色帶為α溶血，有透明帶為β溶血。

1.2.6PCR檢測及16SrRNA克隆測序

1.2.6.1引物設計及合成 用支原體目通用引物［13］、絲狀支原體簇特異性引物［14］、綿羊肺炎支原體特異性引物［15］、精氨酸支原體特異性引物［15］、萊氏無膽甾原體特異性引物［15］和無乳支原體特異性引物［16］對支原體分離株的DNA進行PCR擴增，引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6.2PCR檢測及分離株16SrRNA克隆測序

取1mL支原體培養(yǎng)液加入1.5mL離心管中，10 000r／min離心1min，棄上清收集菌體，用組織DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。PCR反應體系20μL：PremixTaq10μL，RNA Free H2O 4μL，上、下游引物各1μL，模板4μL。反應程序根據各引物參考文獻進行［13－17］，PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。鑒定為陽性的產物用16SrRNA通用引物［17］對支原體分離株的DNA進行PCR擴增。擴增產物送生工生物工程（上海）有限公司進行克隆測序。

1.2.7分離株16SrRNA基因序列同源性分析

采用DNAStar軟件中的MegAlign將測定序列與GenBank中登錄的萊氏無膽甾原體標準株PG8（AL PG8）、絲狀支原體山羊亞種標準株PG3（Mmc PG3）、絲狀支原體絲狀亞種SC型PG1標準株（MmmSC PG1）、山羊支原體山羊亞種分離株G5（Mcc G5）、山羊支原體山羊肺炎亞種標準株F38（Mccp F38）及綿羊肺炎支原體標準株Y98（Mo Y98）等支原體的16SrRNA基因進行同源性分析，構建系統(tǒng)進化樹。參考序列信息見表2。

表2　GenBank中公布的參考序列Table 2 Reference sequences in GenBank

2 結果與分析

2.1菌落形態(tài)觀察

病羊肺臟組織在液體培養(yǎng)基上傳至第1代，培養(yǎng)6d后，培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁，第2代液體培養(yǎng)2d后培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁，經液體、固體培養(yǎng)基進行3輪克隆純化后，在顯微鏡下可見菌落呈油煎蛋狀，有棕黃色中心突起（圖1），將此菌株命名為FJ－NP株。

圖1　分離株的菌落形態(tài)（50×）Fig.1 Colonial morphology of the isolate（50×）

2.2菌體形態(tài)觀察

用吉姆薩染色，在1 000倍顯微鏡下觀察，可見分離菌呈淡紫色，具有高度多形性，以小球狀和桿狀為主（圖2）。

圖2　分離株吉姆薩染色結果（1 000×）Fig.2 Giemsa staining of the isolate（1 000×）

2.3L－型細菌檢驗

FJ－NP株在無抑菌劑的培養(yǎng)液中傳10代，經染色鏡檢和固體培養(yǎng)均未見細菌形態(tài)。

2.4生化鑒定

分離菌株FJ－NP能發(fā)酵葡萄糖，不能水解精氨酸，不分解尿素，氯化四氮唑還原反應陰性，膽固醇需要試驗陰性，能還原美蘭（圖3A），溶血試驗結果陰性（圖3B），血細胞吸附試驗陰性（圖3C）。

圖3　分離株部分生化試驗結果（50×）Fig.3 Part of biochemical test results of isolate（50×）

2.5 支原體分離株PCR檢測

用支原體目16SrRNA通用引物擴增獲得目的條帶560bp，與預期片段大小相符（圖4A）。用萊氏無膽甾原體特異性引物擴增也獲得目的條帶505bp，與預期片段大小相符（圖4B）。用絲狀支原體簇絲狀支原體簇特異性引物、綿羊肺炎支原體特異性引物、無乳支原體特異性引物及精氨酸支原體特異性引物均未擴增出任何條帶。

圖4　分離株PCR檢測結果Fig.4 PCR result of isolated strain

2.6支原體分離株基因序列同源性比對及進化樹分析

將FJ－NP分離株的16SrRNA基因的測序結果提交到NCBI，登錄號：KU870649，該菌株的16SrRNA基因序列與AL PG8株16SrRNA基因序列的同源性為99.8%，與Mcc G5株的同源性為82.8%，與Mccp F38株的同源性為82.2%，與Mmc PG3株的同源性為82.8%，與MmmSC PG1株的同源性為82.8%，與Mo Y98株的同源性為77.7%（圖5）。用DNAStar中的MegAlign軟件構建AL FJ－NP 16SrRNA基因序列的進化樹見圖6。由圖6可知，分離菌株與AL PG8株同屬進化樹的同一分支，親緣關系最近，與其他標準株的親緣關系較遠。

圖5　16SrRNA基因序列同源性比對Fig.5 Homology comparison of 16SrRNA gene sequence

圖6　支原體16SrRNA基因的進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree ofMycoplasma16SrRNA gene sequence

3 討 論

本研究從疑似發(fā)生山羊傳染性胸膜肺炎的病羊肺臟組織中分離到一株支原體，對其進行生化鑒定，結果顯示，該分離株能發(fā)酵葡萄糖，不能水解精氨酸，不分解尿素，膽固醇需要試驗、氯化四氮唑還原反應、溶血試驗和血細胞吸附試驗的結果均為陰性，美蘭還原反應為陽性。這些特性與萊氏無膽甾原體的生化試驗特征相一致；分離株的16SrRNA基因序列與AL PG8的同源性為99.8%，且分離株與其處于支原體16SrRNA進化樹的同一分支上，證明本次從羊肺臟組織中分離到的支原體是萊氏無膽甾原體。

目前，國內外未見從發(fā)病羊肺臟中分離到萊氏無膽甾原體的報道。僅見從牛生殖道中、種馬精液和陜北患流行性陰道子宮內膜炎的驢生殖道分泌物［5］中分離到萊氏無膽甾原體的報道，但這些分離株與動物疫病的關系尚需進一步研究確定。已證實萊氏無膽甾原體是一種植物支原體病的病原，當前尚無可靠證據表明萊氏無膽甾原體能導致人類的疾病，但是近年來的研究發(fā)現萊氏無膽甾原體能產生含有大量毒力因子的細胞外囊泡至環(huán)境中［18］。Chernov等［19］研究結果提示，萊氏無膽甾原體的細胞外囊泡從毒力標準的角度（侵襲性、感染性和產毒性）來看，能夠感染植物，同時具有促進支原體對植物致病的能力。Chernov等［20］研究結果表明，萊氏無膽甾原體的胞外囊泡富集于在支原體誘導的發(fā)病機制中起關鍵作用的蛋白質中。本研究結果證實從羊的肺臟組織中分離到的支原體是萊氏無膽甾原體，提示該養(yǎng)殖場應加強萊氏無膽甾原體的防制，但該分離株與山羊致病性的關系有待進一步的研究。

4 結 論

本研究從疑似發(fā)生羊支原體性肺炎的病山羊肺臟組織中分離到一株疑似萊氏無膽甾原體菌株，菌落形態(tài)觀察、生化鑒定、PCR擴增及克隆測序結果顯示，該分離株為萊氏無膽甾原體，但該分離株與山羊致病性關系有待進一步研究。

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（責任編輯 姚倩倩）

中圖分類號：S858.27

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3329－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.036

收稿日期：2016－04－27

基金項目：福建省科技計劃項目－省屬公益類科研院所基本科研專項“山羊支原體肺炎流行病學和快速檢測技術研究”（2014R1023－6）；福建省科技創(chuàng)新平臺建設項目“羊支原體肺炎和山羊傳染性胸膜肺炎病原快速檢測試劑研究”（2014N2003－5）

作者簡介：江錦秀（1987－），女，福建福州人，碩士，研究實習員，研究方向：動物傳染病，E－mail：15080453371＠163.com

通信作者：＊胡奇林（1963－），男，湖南邵陽人，碩士，研究員，研究方向：動物傳染病學和免疫學，E－mail：hql562713＠163.com

Isolation and Identification ofAcholeplasmalaidlawiiFJ－NP Strains in Goat

JIANG Jin－xiu，LIN Yu－sheng，YOU Wei，JIANG Bin，HU Qi－lin＊
（InstituteofAnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine，FujianAcademyof AgriculturalSciences，Fuzhou350013，China）

Abstract：To confirm the pathogen of a suspected mycoplasmal pneumonia of goat in a farm of Fujian province，the pathogen in the lung tissue was isolated and purified using medium forMycoplasma.It was identified by biochemical test and PCR method，and 16SrRNA gene of the isolate was sequenced.The results showed that the isolate colonies were like fried eggs with brown protrusion in the center，and it could ferment glucose，not hydrolyze arginine and decompose urea，meanwhile，four azole nitrogen chloride reduction reaction，cholesterol test，hemadsorption test，blood adsorption experiment and hemolysis test of isolate were all negative，however，Meilan reduction reaction was positive.The productions of PCR amplification was about 505bp which wasAcholeplasmalaidlawiispecific band.The result of sequence analysis indicated that there was 99.8%homology between the nucleotide sequence of 16SrRNA gene of the isolate and that ofAcholeplasmalaidlawiistrain PG8.The identification results showed that the isolated from the lung tissue of goat wasAcholeplasmalaidlawiicalled FJ－NP strain，while futher study would be needed for the relationship between the pathogentic isolates and goat disease.

Key words：goat mycoplasmal pneumonia；Acholeplasmalaidlawii；isolation；identification