趙衛(wèi)東 忽勝和 楊新原 孔 山

(1 云南省大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室，大理市 671000，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com；2 云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，大理市 671000)

論著·基礎(chǔ)研究

pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)肺炎鏈球菌感受態(tài)菌株耐藥性的影響▲

趙衛(wèi)東1忽勝和2楊新原2孔 山1

(1 云南省大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室，大理市 671000，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com；2 云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，大理市 671000)

目的 探討pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)肺炎鏈球菌(SP)感受態(tài)菌株耐藥性的影響。方法 收集13株對(duì)青霉素不敏感的SP菌株，其中8株青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)編碼基因pbp2b未突變，5株pbp2b基因突變，制備SP感受態(tài)?；瘜W(xué)合成含SSN保守區(qū)的pbp2b基因片段，構(gòu)建pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株。測(cè)定青霉素、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢吡肟5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素(BLA)對(duì)轉(zhuǎn)化前后SP感受態(tài)菌株的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果pbp2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物可見約300 bp的特異條帶，13株SP菌株均能形成感受態(tài)。與轉(zhuǎn)化前菌株比較，5種抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化后菌株的MIC均降低(P<0.05)。5種抗生素對(duì)5株轉(zhuǎn)化后的pbp2b基因突變菌株的MIC均降低(P<0.05)。結(jié)論 外源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SP感受態(tài)可以協(xié)助減緩SP耐藥性的進(jìn)展。

肺炎鏈球菌；青霉素結(jié)合蛋白；感受態(tài)；重組質(zhì)粒；耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶類抗生素

耐青霉素肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)主要是由于SP自身青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)編碼基因突變所產(chǎn)生[1]。感受態(tài)是細(xì)菌自然形成的一種狀態(tài)，可攝取周圍環(huán)境中裸露DNA片段，SP是最易形成感受態(tài)的細(xì)菌[2]。前期試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)臨床分離的13株青霉素不敏感SP中的5株存在PBPs編碼基因pbp2b突變[3]，為了進(jìn)一步探討外源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SP感受態(tài)菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactamase antibiotics，BLA)敏感性所產(chǎn)生的影響，本研究繼續(xù)對(duì)13株臨床分離的青霉素不敏感SP進(jìn)行分析研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與保存 收集臨床送檢的呼吸道感染嬰幼兒的痰或咽拭子標(biāo)本中分離的SP 24株，其中13株為青霉素不敏感菌株，用含30%甘油的腦心浸液肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HB8297-1)在-80℃低溫凍存。前期實(shí)驗(yàn)[3]已驗(yàn)證，這13株青霉素中8株pbp2b基因未突變，5株pbp2b基因突變。

1.2pbp2b基因合成 根據(jù)GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_003098)中SP標(biāo)準(zhǔn)菌R6株(NC-003098)基因序列，化學(xué)合成SP含SSN區(qū)的pbp2b基因片段，序列如下：GCG GTC CAA GCT CTG GAG TAT TCA TCA AAT ACC TAT ATG GTC CAA ACA GCC TTA GGT CTT ATG GGG CAA ACC TAT CAA CCC AAT ATG TTT GTC GGC ACC AGC AAT CTA GAG TCT GCT ATG GAG AAA CTG CGT TCA ACC TTT GGC GAA TAT GGC TTG GGT ACT GCG ACA GGA ATT GAC CTA CCA GAT GAA TCT ACT GGA TTT GTT CCC AAA GAG TAT AGC TTT GCT AAT TAC ATT ACT AAT GCC TTT GGG CAG TTT GAT AAC TAT ACG CCG ATG CAG TTG GCT CAG TAT GTA GCA ACT ATT，共300 bp，由上海鉑尚生物技術(shù)公司合成。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)包含BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切位點(diǎn)的pbp2b基因擴(kuò)增引物，序列如下：上游 5′-CGC GGA TCC GCG GTC CAA GCT CTG GAG TAT-3′，下游 5′-CCA AGC TTA ATA GTT GCT ACA TAC TGA G-3′。將化學(xué)合成的pbp2b基因稀釋至20 pmol，作為擴(kuò)增模板，用2×Taq PCR MasterMix 試劑盒 (北京天根生化科技有限公司，批號(hào)KT201)進(jìn)行PCR。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃延長(zhǎng)5 min，共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物300 bp。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并純化回收。

1.3 pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒構(gòu)建pbp2b擴(kuò)增產(chǎn)物和pUC19載體(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：SD0061)分別用BamH Ⅰ(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：ER0051)和Hind Ⅲ內(nèi)切酶(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：SD0501)進(jìn)行雙酶切，回收pbp2b基因片段和載體片段，根據(jù)連接試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)EL0014)說明書方法，16℃連接過夜，回收pUC19-pbp2b連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：CB101-01)。

1.4 藍(lán)白斑試驗(yàn) 將pUC19-pbp2b轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α接種于含25 mg/ml異丙基硫代半乳糖苷(Sigma公司，批號(hào)：I5502)、20 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(Sigma公司，批號(hào)：B4252)和100 mg/ml氨芐西林(Sigma公司，批號(hào)：A6140)LB平板(海博生物公司，批號(hào)：HB0129)，37℃培養(yǎng)18 h后，挑白色菌落，接種于含100 mg/ml氨芐西林的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床搖菌過夜。用快速質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP105-03)抽提pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒，送上海鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 SP感受態(tài)制備 按照B?ttig等[4]的方法，將-80℃保存的SP迅速置于37℃水浴中3 min以復(fù)蘇菌株，將菌液倒入感受態(tài)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(Sigma公司，批號(hào)：Y1625；其中含C+0.5%酵母抽提物、1 mmol/L CaCl2和5%胎牛血清)中，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃靜置孵育至A600=0.15，即得到感受態(tài)菌株。

1.6 pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SP感受態(tài) 參照周俠等[5]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SP感受態(tài)的方法，將感受態(tài)刺激因子(由上?？齐纳锕竞铣?；氨基酸序列為：EMRLSKFFRDFILQRKK，終濃度為100 ng/ml)加入含SP感受態(tài)菌株的培養(yǎng)液中，同時(shí)將pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒加入，37℃孵育1 h，接種于含氨芐西林(200 μg/ml)的哥倫比亞血平板(生物梅里埃公司，批號(hào)：43041)，5% CO2的培養(yǎng)箱37℃孵育24 h，挑取菌落，接種于腦心浸液培養(yǎng)基(青島海博生物，批號(hào)：HB8297-1)中增菌。

1.7 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)[6]，采用微量肉湯稀釋法，分別測(cè)試轉(zhuǎn)化前后的SP對(duì)青霉素、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢吡肟5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的藥敏性，抗生素稀釋采用2倍稀釋法，濃度范圍為0.125～1 024 μg/ml。質(zhì)控菌為SP ATCC 49619(購自上海樂訊生物公司)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1pbp2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見300 bp左右特異條帶，見圖1。

圖1 pbp2b基因擴(kuò)增條帶

2.2 pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒構(gòu)建 藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白斑為pUC19-pbp2b陽性質(zhì)粒，藍(lán)斑為pUC19-pbp2b陰性質(zhì)粒。見圖2。

圖2 pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)

2.3 SP轉(zhuǎn)化前后藥敏試驗(yàn) 13株青霉素不敏感(包括8株pbp2b基因未突變，5株pbp2b基因突變)SP感受態(tài)制備后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，與轉(zhuǎn)化前菌株比較，青霉素等5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化后菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均降低(P<0.05)，見表1。

表1 13株青霉素不敏感SP 轉(zhuǎn)化前后對(duì)抗生素藥敏性比較

2.4pbp2b基因突變菌株轉(zhuǎn)化前后藥敏試驗(yàn) 轉(zhuǎn)化后，青霉素等5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素對(duì)pbp2b基因突變菌株(第2、5、6、7、10號(hào)菌株)MIC均降低，見表2。

表2 5株pbp2b基因突變菌轉(zhuǎn)化前后對(duì)抗生素藥敏性比較(μg/ml)

3 討 論

BLA通過與細(xì)菌細(xì)胞膜上的PBPs結(jié)合，產(chǎn)生酰胺酶中間物來抑制細(xì)菌繁殖，因此，編碼PBPs的基因(主要包括pbp1a、pbp2b基因)突變是導(dǎo)致SP對(duì)青霉素耐藥的重要原因[7]。本研究的前期結(jié)果以及其他研究均表明，PBPs編碼基因的突變不僅導(dǎo)致了耐青霉素SP的出現(xiàn)，而且也對(duì)其他BLA，如氨曲南、頭孢菌素和替卡西林等抗生素產(chǎn)生交叉耐藥情況，多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)給臨床治療感染帶來巨大挑戰(zhàn)[3，8-9]。

感受態(tài)是SP自然形成的一種狀態(tài)，SP感受態(tài)可以攝取周圍環(huán)境中的DNA片段[10]。SP對(duì)青霉素的耐藥性除了編碼PBPs的基因發(fā)生突變?cè)斐赏?，也可以通過攝取周圍耐藥細(xì)菌的裸露質(zhì)粒而產(chǎn)生，所以，SP感受態(tài)的形成可能也是造成該菌耐藥的重要原因[11]。我們通過對(duì)13株青霉素不敏感菌株感受態(tài)轉(zhuǎn)化前后對(duì)抗生素藥敏性的分析，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)化前菌株比較，青霉素等5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化后菌株的MIC均降低(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)菌株對(duì)抗生素的敏感性均明顯提升。

SPpbp2b基因突變主要發(fā)生在保守序列SSN區(qū)，該區(qū)域T(蘇氨酸)→A(丙氨酸)[12]，因此本研究構(gòu)建了含SSN區(qū)的pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化對(duì)青霉素不敏感pbp2b基因突變SP感受態(tài)菌株和pbp2b基因無突變菌株，檢測(cè)青霉素等5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化菌的MIC，從而分析pbp2b基因在SP耐藥性變異中的作用，同時(shí)探討該方法改變SP耐藥性的可行性。結(jié)果顯示，青霉素等5種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素對(duì)PBPs突變菌株MIC均有不同程度地降低(P<0.05)。這可能是由于感受態(tài)菌株擁有了對(duì)青霉素敏感的保守基因，對(duì)于pbp2b基因突變菌株而言，其可以逆轉(zhuǎn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐藥性，因此將外源質(zhì)粒導(dǎo)入耐藥菌可以恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，而野生型的青霉素敏感SP也可以通過攝取外源耐藥質(zhì)粒來產(chǎn)生耐藥性。因此，這一方面提示pbp2b基因突變?cè)赟P耐藥機(jī)制的重要作用，另一方面也從基因水平為消除SP對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥性提供了一個(gè)新的思路。

綜上所述，外源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SP感受態(tài)可以協(xié)助減緩SP耐藥性的進(jìn)展。由此可見，要阻止耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，一方面在臨床感染性疾病的治療中合理適量應(yīng)用抗生素，另一方面，尋找對(duì)抗細(xì)菌耐藥性的新藥物以及合適的方法也同樣重要。

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Effect of transformation by recombinant plasmid pUC19-pbp2bon drug resistance of competent strain ofStreptococcuspneumoniae

ZHAOWei-dong1,HUSheng-he2,YANGXin-yuan2,KONGShan1

(1DepartmentofLaboratoryDiagnostics,ClinicalMedicineCollegeofDaliUniversity,Dali671000,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To explore the effect of transformation by recombinant plasmid pUC19-pbp2bon the drug resistance of competent strain ofStreptococcuspneumoniae.Methods ThirteenStreptococcuspneumoniaestrains insensitive to penicillin were collected,including 8 strains withoutpbp2bmutation of penicillin-binding proteins(PBPs) gene and 5 strains withpbp2bgene mutation.All strains were used for the preparation of competent strain ofStreptococcuspneumoniae.pbp2bfragment containing SSN conservative region was chemically synthesized and then recombinant plasmid pUC19-pbp2bwas constructed.And the recombinant plasmid was transformed into competent strains.The minimum inhibitory concentrations(MICs) of five β-lactamase antibiotics(including penicillin,cefuroxime,cefotaxime,ceftriaxone and cefepime) for the pre- and post-transformed competent strains ofStreptococcuspneumoniaewere determined.Results A specific band of about 300 bp was observed in the amplification product ofpbp2bgene.Competence strains of 13Streptococcuspneumoniaestrains were successfully obtained.The MICs of 5 antibiotics for the post-transformed strains decreased compared to those for the pre-transformed strains(P<0.05).The MICs of 5 antibiotics for 5 strains withpbp2bgene mutation after transformation decreased(P<0.05).Conclusion Competent strain ofStreptococcuspneumoniaetransformed by exogenous recombinant plasmid is helpful for slowing down the progression of the drug resistance toStreptococcuspneumoniae.

Streptococcuspneumoniae,Penicillin-binding protein,Competence,Recombinant plasmid,Drug resistance,β-lactamase antibiotics

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2013FD095)

趙衛(wèi)東(1983～)，男，在讀博士研究生，助教，研究方向：臨床病原微生物。

孔山(1972～)，男，在職研究生，講師，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。E-mail：185354177@qq.com。

R 378.14

A

0253-4304(2016)11-1485-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.11.02

2016-06-05

2016-08-02)