楊明建,鄭 燕,陳建中,申海玉,張 浩,韓孟麗,劉志梅

(1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北邯鄲 056005;2.邯鄲學(xué)院數(shù)理學(xué)院,河北邯鄲 056005)

金銀花提取物對中波紫外線輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用

楊明建1,鄭 燕2,陳建中1,申海玉1,張 浩1,韓孟麗1,劉志梅1

(1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北邯鄲 056005;2.邯鄲學(xué)院數(shù)理學(xué)院,河北邯鄲 056005)

研究金銀花提取物對中波紫外線(UVB)輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用。將60只雄性小鼠隨機(jī)分為6組,分別為空白對照組、金銀花提取物單獨(dú)處理組、輻射模型組、金銀花提取物低、中、高劑量處理組。其中金銀花提取物單獨(dú)處理組和低、中、高劑量組每天上午灌胃400、200、400和600 mg·kg-1·d-1的金銀花提取物,空白和輻射模型組灌胃生理鹽水,除空白和金銀花提取物單獨(dú)處理組外,其余4組均在下午接受3 h的UVB(285 nm)照射。實(shí)驗(yàn)處理30 d后,測定各組小鼠睪體比、精子活率、睪丸組織病理學(xué)變化及超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果表明,與空白對照組相比,輻射模型組小鼠睪體比和精子活率均顯著下降(p<0.05),睪丸曲細(xì)精管生精上皮排列疏松,可見生精細(xì)胞脫落至管腔,睪丸組織SOD活性顯著降低而MDA含量顯著升高(p<0.01)。與輻射模型組相比,金銀花提取物低、中、高劑量處理組小鼠睪體比和精子活率均顯著升高(p<0.05),生精上皮排列越來越致密,睪丸組織SOD活性顯著增加而MDA含量顯著下降(p<0.01),并且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明,金銀花提取物對UVB輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷有一定的保護(hù)作用。

中波紫外線,金銀花提取物,生殖系統(tǒng),超氧化物歧化酶,丙二醛

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境問題日益突出,導(dǎo)致大氣中臭氧層受破壞的程度逐年升高,陽光中到達(dá)地面的紫外線逐漸增加,由于累積效應(yīng)引起的輻射生物學(xué)損傷也越來越嚴(yán)重[1]。根據(jù)紫外線的生物學(xué)效應(yīng)可將其分為長波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)和短波紫外線(UVC),由于能夠到達(dá)地球地面的UVB的殺傷力較UVA更強(qiáng),研究UVB輻射對生物體的損傷具有十分重要的意義。大量研究證實(shí),過量的UVB暴露能夠引起皮膚、角膜、視網(wǎng)膜的光老化及免疫系統(tǒng)抑制等[2-5]。如何防治紫外線輻射損傷,尋找天然、高效、穩(wěn)定、低毒乃至無毒的抗輻射制劑和自由基清除劑已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)工作者共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。近年來的研究發(fā)現(xiàn),UVB輻射能夠造成雄性小鼠生殖系統(tǒng)的損傷[6],引起雄性小鼠增重減慢、睪體比降低、精子活率下降、睪丸組織病變、SOD 活性降低和MDA含量增加,但對精子畸形率影響不大。

研究表明,三七皂苷、茶多酚、枸杞多糖等天然植物化合物都具有較強(qiáng)的抗輻射能力[7-12],以天然植物為原料研究和開發(fā)抗輻射保健食品具有十分廣闊的前景。金銀花是由忍冬科植物金銀花(Lonicera japonica)的花蕾及初開的花干制所得,2002年被原衛(wèi)生部列入第一批《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》。大量研究證實(shí),金銀花提取物含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素、揮發(fā)油、總黃酮、三萜皂苷等多種對人體有益的生物活性物質(zhì),具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗氧化、清除自由基、保肝利膽和提高機(jī)體免疫力等多種活性功能[13-19],但金銀花提取物對UVB輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的影響在國內(nèi)外都鮮見報道。本研究通過測定不同劑量金銀花提取物對受UVB照射小鼠增重、睪體比、精子活率、睪丸組織病理學(xué)變化以及SOD活力和MDA含量等指標(biāo)的變化,評價金銀花提取物對UVB輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用,以期為金銀花類保健食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含20%綠原酸的純天然金銀花提取物 西安瑞林生物科技有限公司;超氧化物歧化酶、丙二醛、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;硫化鈉、乙酸、無水乙醇、甲醇、二甲苯、蘇木精、伊紅、鹽酸乙酸、蛋白膠 均為分析純;清潔級、昆明種雄性小鼠 60只,體重20.1～24.3 g,購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部,使用許可證號:SYXK(冀)2009-0045,生產(chǎn)許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。

紫外誘變超凈工作臺 濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠;紫外線強(qiáng)度測量儀 北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司;石蠟切片機(jī) 德國LEICA公司;CX31型光學(xué)生物顯微鏡 日本OLYMPUS公司;721分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;TGL-16B型臺式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DY89-Ⅰ型電動玻璃勻漿器 寧波新芝科學(xué)器材研究所;超級恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 UVB輻射模型建立與小鼠分組 UVB輻射模型的建立參考已發(fā)表論文并做適當(dāng)修改[6]。60只雄性小鼠隨機(jī)分為6組(每組10只),分別為空白對照組、金銀花提取物單獨(dú)處理組、輻射模型組、金銀花提取物低、中、高劑量處理組。金銀花提取物的灌胃劑量參考已發(fā)表的論文[15],其中金銀花提取物單獨(dú)處理組每天上午灌胃400 mg·kg-1·d-1的金銀花提取物;金銀花提取物低、中、高劑量處理組每天上午分別灌胃200、400和600 mg·kg-1·d-1的金銀花提取物;空白和輻射模型組灌胃生理鹽水;除空白和金銀花提取物單獨(dú)處理組外,其余4組小鼠均在下午接受3 h的UVB(285 nm)照射,照射強(qiáng)度為1.5 mW/cm2,UVB輻照劑量累計為13.1 J/cm2,連續(xù)處理30 d。

1.2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

1.2.2.1 小鼠體重、睪丸重量與睪體比測定 將各組小鼠稱體重后采用斷脊髓法處死,立即解剖并取出雙側(cè)睪丸,生理鹽水沖洗,分離睪丸上的附睪備用,稱取睪丸的重量,并計算睪體比(g/100 g)。

1.2.2.2 小鼠附睪精子活率測定 剪開陰囊,從睪丸兩側(cè)分離附睪,放入盛有生理鹽水的小燒杯,生理鹽水的溫度要保持在37 ℃ 5 min,剪碎附睪,使溢出的精子充分混勻制成精子懸濁液。取一滴精子懸液滴于載玻片上,推成薄片,自然晾干后加入甲醇中固定5 min。晾干后,將涂片放入1%伊紅染液中染色1 h,用蒸餾水充分洗滌后,自然晾干,進(jìn)行顯微觀察,每只小鼠檢查完整不重疊的精子1000條,計算精子活率。

1.2.2.3 睪丸組織病理學(xué)檢查 獲得睪丸標(biāo)本后,用布氏液固定,常規(guī)石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色,顯微鏡下觀察。

1.2.2.4 小鼠睪丸組織SOD活力和MDA含量的測定 取右側(cè)睪丸標(biāo)本,制備10%的組織勻漿,按照試劑盒產(chǎn)品說明書中的操作流程測定睪丸組織中SOD活性和MDA含量。

表1 各組小鼠增重、睪丸重量和睪體比

注:與空白對照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與輻射模型組相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;表2、表3同。2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠增重、睪丸重量和睪體比的變化

實(shí)驗(yàn)過程中,除輻射對照組小鼠死亡2只,金銀花提取物低劑量組死亡1只以外,其余各組小鼠均存活。由表1可知,與空白對照組相比,輻射模型組小鼠增重、睪丸重量和睪體比均顯著降低(p<0.05),表明UVB輻射能夠顯著降低小鼠體重的增長速度,引起睪丸重量和睪體比的下降;金銀花提取物單獨(dú)處理組小鼠睪體比顯著升高(p<0.05),小鼠增重和睪丸重量變化不顯著(p>0.05),說明金銀花提取物本身具有升高睪體比的作用;與輻射模型組相比,金銀花提取物低、中、高劑量處理組小鼠增重、睪丸重量和睪體比均顯著升高(p<0.05),且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明,不同劑量金銀花提取物能夠顯著抑制UVB輻射處理引發(fā)的小鼠增重、睪丸質(zhì)量和睪體比的下降,改善UVB輻射對小鼠機(jī)體和睪丸造成的損傷。

2.2 各組小鼠附睪精子活率的變化

由表2可知,與空白對照組相比,輻射模型組小鼠精子活率顯著降低(p<0.05),而金銀花提取物單獨(dú)處理組小鼠精子活率變化不顯著(p>0.05),說明UVB輻射能夠?qū)е滦坌孕∈笊硴p傷,而金銀花提取物本身對小鼠精子活率無顯著影響;與輻射模型組相比,金銀花提取物低、中、高劑量組小鼠精子活率均顯著升高(p<0.05),而且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,說明金銀花提取物對輻射處理引發(fā)精子活率的下降有改善作用。

表2 金銀花提取物對輻射處理引發(fā)精子活率下降的改善作用

2.3 各組小鼠睪丸組織病理學(xué)變化

由圖1(A)可見,空白對照組小鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮管壁完整,由基底面到管腔面各層生精細(xì)胞排列致密,層次鮮明;金銀花提取物單獨(dú)處理組與空白對照組類似(圖1B)。由圖1(C)可見,輻射模型組小鼠曲細(xì)精管管壁出現(xiàn)裂痕,生精上皮層次紊亂,大量生精細(xì)胞脫落至管腔,說明UVB輻射能夠造成小鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮和生精細(xì)胞的損傷。金銀花提取物低劑量組小鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮排列疏松,層次不鮮明,亦可以看到少量生精細(xì)胞脫落至管腔(圖1D);圖1(E)為金銀花提取物中劑量組小鼠生精上皮排列越來越致密,層次越來越鮮明,未見脫落的生精細(xì)胞(圖1E);金銀花提取物高劑量組小鼠生精細(xì)胞層次更加致密和整齊(圖1F)。以上結(jié)果表明,金銀花提取物能夠改善UVB輻射誘發(fā)的睪丸組織病理學(xué)損傷,維持生精上皮的完整性。

圖1 各組睪丸組織病理學(xué)變化(400×)Fig.1 Histopathological changes in testis of mice in each group(400×)注:A:空白對照組;B:金銀花提取物單獨(dú)處理組;C:輻射模型組;D:金銀花提取物低劑量組;E:金銀花提取物中劑量組;F:金銀花提取物高劑量組。

2.4 各組小鼠睪丸組織SOD活力和MDA含量的變化

SOD是一種抗氧化酶,其活力高低可間接反映機(jī)體對自由基的清除能力;MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[19-20]。由表3可知,與空白對照組相比,輻射模型組小鼠睪丸組織SOD活力極顯著降低(p<0.01),而MDA含量極顯著增加(p<0.01),說明UVB輻射能夠引發(fā)小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激。與空白對照組相比,金銀花單獨(dú)處理組小鼠睪丸組織SOD活力顯著升高(p<0.05),而MDA含量顯著降低(p<0.05),說明金銀花提取物單獨(dú)處理可以顯著增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力;與輻射模型組相比,金銀花提取物低、中、高劑量組睪丸組織SOD活力極顯著升高(p<0.01),而MDA含量極顯著降低(p<0.01),說明金銀花提取物能夠通過增強(qiáng)小鼠抗氧化能力來降低由UVB輻射引發(fā)的小鼠氧化應(yīng)激。

表3 各組小鼠睪丸組織超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)金銀花提取物能夠顯著抑制UVB輻射處理所致的雄性小鼠增重、睪丸質(zhì)量和睪體比的下降,明顯改善UVB輻射所致的精子活率下降和睪丸組織病理學(xué)損傷,并維持曲細(xì)精管生精上皮的完整性。此外,金銀花提取物還能夠通過顯著升高睪丸組織SOD活力來增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力,通過降低MDA含量來改善UVB輻射所致的小鼠氧化損傷,并且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,在高劑量下未呈現(xiàn)毒副作用。以上研究結(jié)果表明,金銀花提取物在抗輻射保健食品的開發(fā)方面具有很大的潛力,本實(shí)驗(yàn)針對金銀花提取物對UVB輻射所致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用進(jìn)行評價,但其具有抗輻射活性的主要有效成分尚不十分清楚,防護(hù)機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

[1]周美娟,鄭莉,郭玲,等. 紫外輻射的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制[J]. 生物物理學(xué)報,2010,26(11):950-958.

[2]Izabela D,Barbara SP,Elzbieta S,et al. Effects of UVB radiation on the physicochemical properties of fibroblasts and keratinocytes[J]. Journal of Membrane Biology,2016,249(3):319-325.

[3]Ubels JL,Glupker,CD,Schotanus,MP,et al. Involvement of the extrinsic and intrinsic pathways in ultraviolet B-induced apoptosis of corneal epithelial cells[J]. Experimental Eye Research,2016,145:26-35.

[4]吳亮宇. UVB對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的輻射損傷及茶多酚的保護(hù)作用[D]. 杭州:浙江大學(xué). 2010.

[5]錢曉微,吳秀毅,林國棟,等. 紫外線對小鼠免疫遺傳的損傷效應(yīng)[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報,2010,32(2):277-280.

[6]楊明建,鄭燕,申海玉,等. 中波紫外線致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2012,29(6):347-354.

[7]羅琦,梁慶模. 天然藥物抗輻射損傷作用機(jī)制的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,13(3):209-211.

[8]王麗,王振宇,張浩,等. 天然化合物的電離輻射防護(hù)作用研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(16):372-376.

[9]王崇道,強(qiáng)亦忠. 電離輻射所致自由基對機(jī)體的損傷與自由基清除劑的研究[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2002,22(6):461-463.

[10]董銳濤,唐麗媛. 三七皂苷抗皮膚光損傷、光致癌作用及機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 新醫(yī)學(xué)學(xué)刊,2008,5(4):544～546.

[11]譚克為,羅瓊. 枸杞多糖對照射大鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2008,28(3):258-259.

[12]鄭燕,楊明建,申海玉,等. 茶多酚對UVB照射雄性小鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用[J]. 河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,41(3):19-23.

[13]Ilies DC,Radulescu V,Dutu L. Volatile constituents from the flowers of two species of honeysuckle(LonicerajaponicaandLoniceracaprifolium)[J]. Farmacia,2014,62(1):194-201.

[14]關(guān)炳峰,譚軍,周志娣. 金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(10):127-129.

[15]周春暉,蘇燁,李鳳芝. 金銀花提取物對小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2010,26(4):351-353.

[16]宮璀璀,鄭玉霞,鄭乃剛,等. 金銀花在體內(nèi)抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 實(shí)用醫(yī)藥雜志,2006,23(5):584-586.

[17]宋海英,邱世翠,王志強(qiáng). 金銀花的體外抑菌作用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2003,14(5):269.

[18]Park JW,Bae H,LEE G,et al. Prophylactic effects ofLonicerajaponicaextract on dextran sulphate sodium-induced colitis in a mouse model by the inhibition of the Th1/Th17 response[J]. British Journal of Nutrition,2013,109(2):283-292.

[19]胡成穆,姜輝,劉洪峰,等. 金銀花總黃酮對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中藥藥理與臨床,2007,23(9):93-97.

[20]Wei YM,Li WG. The effects of sijunzi decoction on anti-lipid peroxidation and active oxygen free radicalsinvitro[J]. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences,2002,32(2):32-33.

Protective effects of honeysuckle extract against the uvb-induced radiation damage to reproductive system in male mice

YANG Ming-jian1,ZHENG Yan2,CHEN Jian-zhong1,SHEN Hai-yu1, ZHANG Hao1,HAN Meng-li1,LIU Zhi-mei1

(1.College of Life Science and Engineering,Handan College,Handan 056005,China; 2.College of Mathematics and Physics,Handan College,Handan 056005,China)

The aim of this study was to investigate the protective effects of honeysuckle extract against the Ultraviolet B(UVB)-induced radiation damage to reproductive system in male mice. Sixty male mice were randomly divided into 6 groups,the blank control group,the honeysuckle extract single treatment group,the radiation model group and the honeysuckle extract low,middle,high dosage-treated groups. The mice in honeysuckle extract single treatment group and low,middle,high dosage-treated groups were given 400,200,400 and 600 mg·kg-1·d-1honeysuckle extract by intragastric administration respectively. The blank control and radiation model group were given normal saline. The mice were all given orally in the morning. The rest of the four groups were given 3 hours of UVB(285 nm)radiation in the afternoon except the blank control and honeysuckle extract single treatment group. After 30 days,the testis to body ratio,sperm motility rates,histopathological changes in testis,the SOD activity and MDA content of testicular tissue were determined. When compared to the blank control group,the,testis to body ratio and sperm motility rates of mice in the radiation model group declined significantly(p<0.05). The spermatogenic epitheliums were loosely-arranged and spermatogenic cells were fell into the tubules,the SOD activity degraded and MDA content raised significantly as well(p<0.01). The testis to body ratio,SOD activity increased,MDA content decreased significantly in the honeysuckle extract single treatment group(p<0.05). Compared to the radiation model group,with the increase of honeysuckle extract dosage,the testis to body ratio and the sperm motility rates in the honeysuckle extract-treated groups raised significantly(p<0.05),the spermatogenic epitheliums were more and more impact,the SOD activity raised and the MDA content of testicular tissue degraded notably(p<0.01),and all these changes showed obvious dose-effect relationship. The results suggest that honeysuckle extract has protective effects against the UVB-induced radiation damage to reproductive system in male mice.

Ultraviolet B;honeysuckle extract;reproductive system;SOD;MDA

2016-06-15

楊明建(1981-),男,碩士,副教授,研究方向:天然食藥植物活性物質(zhì)檢測與研發(fā),E-mail:yangmingjian107@126.com。

河北省科技計劃項(xiàng)目(12272502);邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項(xiàng)目(1422104057-2、1323108093-9、0821107050-2)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000