鴨瘟與鴨坦布蘇病毒病活疫苗聯(lián)合免疫效果研究

韓建文 申茂欣 蔡聯(lián)燊 楚電峰 李凱善 夏娜 杜元釗

摘 要：鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗與鴨坦布蘇病毒病活疫苗通過肌肉注射途徑，同時(shí)接種21日齡健康易感肉鴨，檢測兩種活疫苗聯(lián)合免疫的安全性和免疫效力。將兩種活疫苗同時(shí)免疫雛鴨，免疫后14d檢測血清抗體值，并在14d時(shí)采用鴨瘟強(qiáng)毒和鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株同時(shí)攻毒，觀察試驗(yàn)組與對照組的攻毒保護(hù)情況。結(jié)果表明：兩種活疫苗聯(lián)合免疫健康易感雛鴨后，血清抗體上升快，可同時(shí)抵御鴨瘟強(qiáng)毒與鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株的攻擊，保護(hù)效果良好。結(jié)論：鴨瘟與鴨坦布蘇病毒病活疫苗聯(lián)合免疫，對雛鴨安全，免疫保護(hù)效果好，避免多次免疫對雛鴨帶來的應(yīng)激反應(yīng)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞：鴨瘟；鴨坦布蘇病毒；聯(lián)合免疫

中圖分類號：S858.322.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2016）02-0037-06

鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的一種急性接觸性傳染病，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最重要疾病之一，該病流行廣泛，傳播迅速，其特征為血管破壞、組織出血、淋巴器官損傷和實(shí)質(zhì)器官變性。病鴨體溫升高，兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大；食道粘膜有小出血點(diǎn)，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔粘膜充血、出血、水腫和假膜覆蓋[1]。早在1923年荷蘭已有鴨瘟流行，以后在印度、比利時(shí)、意大利、英國、法國、德國和加拿大也有發(fā)現(xiàn)，1967年在美國東海岸流行，稱為鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE），我國1957年首次報(bào)道本病，目前我國采用的鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗保護(hù)雛鴨免受強(qiáng)毒攻擊，效果良好。鴨坦布蘇病毒病是新發(fā)現(xiàn)的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的傳染病，目前尚沒有商品化的疫苗可預(yù)防和控制該病。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所聯(lián)合青島易邦生物工程有限公司最新研制的鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗（FX2010-180P 株），能有效保護(hù)雛鴨抵御強(qiáng)毒攻擊，且對雛鴨安全，無任何免疫副反應(yīng)[2]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RNAiso Plus、RNA酶抑制劑（RRI）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自大連寶生物（Takara）；PCR Mix（廣州東盛生物科技有限公司）；75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）、無RNase的水、分析純的氯仿、異丙醇和乙醇；鴨坦布蘇病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。

1.2 毒種和細(xì)胞 鴨坦布蘇病毒疫苗毒（FX2010-180P株）、檢驗(yàn)用毒（FX2010株）及DF1細(xì)胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供；鴨瘟雞胚化弱毒株和鴨瘟檢驗(yàn)用強(qiáng)毒由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)[4] 根據(jù)坦布蘇病毒（FX2010）E基因序列設(shè)計(jì)兩對特異性的重疊引物：

P1： 5'-AGACTGCTGGTGCAATGAGAC-3'；

P2： 5'-CGGTACCATAATCCTCCATCTCAGC-3'；

P3： 5'-CATAGGCTGGAATCTGGGAAC-3'；

P4： 5'-TCTGGATTCTGTCGTCACGTC-3'引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀釋至終濃度為10μmol/L，分裝后凍存于-20℃。

1.4 病毒RNA的提取 取1.5ml Eppendorf管，向其內(nèi)加入500μl待檢病毒液、800μl Trizol（Invitrogen），靜置5min；加入0.2ml氯仿，振蕩15S，靜置2～3min；4℃離心10min，吸取上清并加入等體積的異丙醇，沉淀10min；4℃ 10800×g離心10min，棄上清，用75%酒精清洗沉淀，混勻后，10800×g離心10min；倒掉上清，RNA自然干燥，用20μl DEPC水溶解RNA。

1.5 反轉(zhuǎn)錄 將5μl RNA提取液與2μl Random 9（TaKaRa）混勻，70℃保溫10min，迅速冰浴2min，然后分別加入4μl 5×AMV Buffer、1μl RRI、1μl AMV（Takara）、lμl 10μmol/L dNTP、6μl DEPC水，共20μl，混勻后30℃保溫10min，42℃ lh，75℃ 10min。

1.6 套式RT-PCR方法的建立 第一輪PCR采用25μl反應(yīng)體系：l2.5μl PCR Mix，1μl P1（10 μmol/L），lμl P2（10μmol/L），1μl cDNA模板，滅菌ddH2O補(bǔ)加至25μl。置于PCR儀中，94℃預(yù)變性4min；94℃變性30S，53℃退火30S，72℃延伸lmin，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。第二輪PCR采用25μl體系：取第一輪PCR反應(yīng)液1μl為模板，12.5μl PCR Mix、lμl P3（10μmol/L）、lμl P4（10μmol/L），滅菌ddH2O補(bǔ)加至25μlL，置于PCR儀中。94℃預(yù)變性4min；94℃變形30S，53℃退火30S，72℃延伸30S，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.0%瓊脂糖電泳，陽性樣品應(yīng)該出現(xiàn)299bp特異性條帶，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.7 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；21日齡商品肉鴨購自壽光某養(yǎng)殖場。

1.8 活疫苗的制備

1.8.1 鴨瘟活疫苗制備 鴨瘟雞胚化弱毒株用滅菌PBS（0.01mol/L，pH7.2）100倍稀釋后經(jīng)過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，37℃孵育，收集48～120h死亡的雞胚，置2～8℃冷卻后，收獲死亡胎兒，經(jīng)研磨、凍融及80目濾網(wǎng)過濾后上清液加入一定比例的5%蔗糖脫脂奶穩(wěn)定劑凍干制備1000羽/瓶規(guī)格的疫苗。

1.8.2 鴨坦布蘇病毒病活疫苗制備 鴨坦布蘇病毒疫苗毒（FX2010-180P株）接種單層原代雞胚成纖維細(xì)胞，37℃孵育，待細(xì)胞出現(xiàn)70%以上CPE時(shí)，收獲病毒液，加一定比例的明膠蔗糖保護(hù)劑凍干制備200羽/瓶規(guī)格的疫苗。

1.9 疫苗安全性觀察 32只21日齡商品肉鴨隨機(jī)分成4組，8只/組，分別標(biāo)記為A、B、C、D組，按如下分組進(jìn)行免疫，免疫后連續(xù)觀察14d，記錄試驗(yàn)鴨采食、精神狀態(tài)及14d后剖檢臟器的病變情況，見表1。

1.10 免疫與攻毒 將43只21日齡經(jīng)過檢測鴨坦布蘇及鴨瘟抗原、抗體均陰性的商品肉鴨隨機(jī)分成4組，分別標(biāo)記為E、F、G、H組，按如下分組進(jìn)行編號和免疫，分別于免疫前和免疫后14d，腳跟靜脈釆血監(jiān)測抗體水平，并于免疫后14d按試驗(yàn)分組分別攻擊相應(yīng)毒株，持續(xù)觀察16d，記錄試驗(yàn)鴨采食、精神狀況。其中攻擊鴨坦布蘇強(qiáng)毒的試驗(yàn)鴨（連同對照組）從攻毒后第4天開始每隔3d采血2只并處死取脾、肺、腎及腦部臟器進(jìn)行病毒分離，而攻擊鴨瘟組在攻毒結(jié)束采集脾臟和腦部組織進(jìn)行病毒分離和PCR檢測，見表2。

1.11 鴨坦布蘇病毒PCR檢測 將采的脾臟按1g加1ml PBS的比例研磨，按1.4～1.6操作進(jìn)行PCR檢測。

1.12 病毒分離 將同一試驗(yàn)動(dòng)物采集臟器組織混合研磨，4℃ 8000rpm離心10min取上清，按終濃度100IU/ml加入青鏈霉素，其中鴨瘟攻毒組處理后的組織液經(jīng)過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種3枚，0.2ml/枚，37℃孵育120h，對未死亡雞胚進(jìn)行盲傳一代，觀察雞胚死亡情況；鴨坦布蘇病毒攻毒組處理的組織液接種DF1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，將70%長滿的48孔細(xì)胞單層棄液后用無血清DMEM清洗3遍，每孔加入待檢組織毒10μl，每個(gè)樣品加3孔，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱感作1.5h，每孔補(bǔ)加2%胎牛血清DMEM200μl，培養(yǎng)6d，盲傳2代觀察細(xì)胞病變情況。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)疫苗質(zhì)量檢測 鴨瘟活疫苗：104.13ELD50/羽[3]，鴨坦布蘇毒活疫苗：104.0TCID50/羽。

2.2 疫苗安全性觀察結(jié)果 從表3“疫苗安全性觀察結(jié)果”和表4“安檢動(dòng)物剖檢結(jié)果”來看，鴨瘟活疫苗和鴨坦布蘇病活疫苗無論單獨(dú)使用還是兩者聯(lián)合使用于21日齡商品肉鴨，均未對商品肉鴨造成采食、精神狀態(tài)以及內(nèi)部臟器等的損害，說明兩種疫苗聯(lián)合使用是安全的。

2.3 免疫與攻毒前后鴨坦布蘇抗體監(jiān)測 從表5“免疫與攻毒前后鴨坦布蘇抗體檢測結(jié)果”來看，試驗(yàn)鴨在經(jīng)歷含鴨坦布蘇病活疫苗免疫及鴨坦布蘇強(qiáng)毒攻擊前后，鴨坦布蘇ELISA抗體阻斷率均有不同程度的升高，其中F組（鴨坦布蘇病活疫苗單苗）與G組（鴨坦布蘇病活疫苗+鴨瘟活疫苗聯(lián)合使用）在免疫前后ELISA抗體阻斷率雖然均為全部轉(zhuǎn)陽，但阻斷率為G組優(yōu)于F組；而經(jīng)過鴨坦布蘇強(qiáng)毒攻擊14d后，H組ELISA抗體阻斷率上升幅度最高，相對而言G組上升幅度低于其他各組，說明鴨坦布蘇病活疫苗+鴨瘟活疫苗兩種疫苗聯(lián)合使用不但不相互抑制反而起到互補(bǔ)作用。

2.4 攻毒觀察結(jié)果 從表6“鴨瘟攻毒組攻毒后觀察結(jié)果”和表7“鴨坦布蘇攻毒組攻毒后觀察結(jié)果”來看，鴨瘟活疫苗和鴨坦布蘇病活疫苗無論單獨(dú)使用還是兩者聯(lián)合使用，均能耐受鴨瘟和鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株的攻擊，均未表現(xiàn)出特異性臨床癥狀，攻擊鴨瘟強(qiáng)毒對照組試驗(yàn)動(dòng)物（H1～H4）從攻毒后第5天開始出現(xiàn)發(fā)病或死亡現(xiàn)象并于第9天全部死亡；攻擊鴨坦布蘇強(qiáng)毒對照組試驗(yàn)動(dòng)物（H5～H14）從攻毒后第2天開始出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象并持續(xù)到第9天，累計(jì)發(fā)病比例達(dá)9/10（90%）。

2.5 病毒分離結(jié)果 從表8“鴨瘟攻毒組病毒分離結(jié)果”和表9“鴨坦布蘇病毒攻毒組病毒分離結(jié)果”來看，無論兩種疫苗單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用，免疫組攻毒后均不能從臟器中分離到病毒，而攻毒對照組只有鴨坦布蘇對照組有1只未分離到病毒外其余均分離到病毒。

2.6 鴨坦布蘇攻毒組臟器PCR檢測 見圖1。從鴨坦布蘇病毒攻毒組攻毒后脾臟含毒PCR檢測結(jié)果來看對照組除1只（H13）外其余發(fā)病個(gè)體均檢測到病毒，而鴨坦布蘇單苗組和鴨瘟與鴨坦布蘇聯(lián)合免疫組在攻毒后7內(nèi)檢測到病毒但7d以后無法檢測。結(jié)合病毒分離結(jié)果，表明該檢測毒不具活性，無法進(jìn)行病毒復(fù)制。

3 討論

3.1 疫苗安全性 突出兩種疫苗聯(lián)合免疫對肉鴨不產(chǎn)生副反應(yīng)。

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，疫苗的安全性尤為重要，疫苗的安全性極大地限制了疫苗的使用。在本研究中，對21日齡商品肉鴨免疫鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗，觀察肉鴨所產(chǎn)生的副反應(yīng)，結(jié)果表明：聯(lián)合免疫這兩種疫苗，并不會產(chǎn)生不良副反應(yīng)。具有單獨(dú)免疫的安全性。這為鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗兩種疫苗的聯(lián)合免疫奠定基礎(chǔ)。

3.2 疫苗聯(lián)合免疫作用 在疫苗安全性得到保證的前提下，保證免疫效果是疫苗使用的又一重要目標(biāo)。鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗兩種疫苗聯(lián)合免疫，從血清抗體結(jié)果上來看，高于單獨(dú)免疫的抗體。并且對鴨坦布蘇攻毒后脾臟含毒PCR檢測及病毒分離結(jié)果來看，聯(lián)合免疫有助于疫苗抗體提升。這說明，聯(lián)合免疫這兩種疫苗，減少了免疫次數(shù)，但是卻能獲得比單獨(dú)免疫更高的抗體水平。

3.3 客戶的使用選擇 疫苗的宗旨是安全、有效、方便。本研究中，我們對比了聯(lián)合免疫鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗。該方法既保證了使用的安全性，又提高了抗體水平，減少了免疫次數(shù)，真正做到了安全、有效、方便。為水禽養(yǎng)殖戶在鴨瘟和鴨坦布蘇病毒病的預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，第四版2001：330-333.

[2] 吳曉剛，高旭元，余磊，等.鴨坦布蘇病毒活疫苗（FX2010-180P株）毒種保存期的研究[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，201422（3）：14-18.

[3] 陳樨，陳晟生.鴨瘟活疫苗雞胚效檢與免疫攻毒保護(hù)的平行關(guān)系[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（6）：29-30.

[4] 顏丕熙，李國新，吳曉剛，等.應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測鴨坦布蘇病毒[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2011，19（3）：34-37.