吳　碩　牛　健　李　麗　劉　冰　閆加興　曲學華

喉癌患者血漿中miRNA表達及基于靶基因的能量消耗的研究

吳碩牛健李麗劉冰閆加興曲學華

【摘要】目的研究喉癌患者血漿中miRNA表達及基于靶基因的能量消耗。方法收集5例喉癌患者的病理組織。空腹抽血，分離人喉癌細胞系Hep2，從HEp2細胞中提取所有RNA。同時采用食物頻率問卷(FFQ)收集患者日常飲食頻率。同時進行營養(yǎng)生物標志物研究，記錄4天的飲食記錄(4DFR)進行飲食調(diào)整(DM)。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，與無轉(zhuǎn)染的喉癌細胞比較，在pcDNA3/ Pri-miR-1轉(zhuǎn)染的HEp2喉癌細胞中miR-1水平升高3.8倍。但是在miR-1 ASO轉(zhuǎn)染的HEp2細胞中miR-1下降了70%。miR-1能夠促進HEp2細胞集落形成，但不影響細胞生存力。患者能量消耗研究發(fā)現(xiàn)，與對照患者比較，脂肪和總能量消耗增加的風險因素是喉癌患者的身體質(zhì)量指數(shù)和年齡。結(jié)論研究表明，miRNA可改變癌癥細胞中的脂質(zhì)和氨基酸代謝；miRNA可以成為治療癌癥的新靶點。

【關鍵詞】喉癌；miRNA；能量消耗；風險比；臨床治療

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:018～021)

MicroRNAs(miRNA)是非編碼小RNA，其負面通過與它們的靶基因的mRNA的非編碼區(qū)3相互作用，實現(xiàn)mRNA翻譯或穩(wěn)定性調(diào)節(jié)作用[1]。mRNA的3＇非編碼區(qū)包含關鍵的穩(wěn)定要素，其受到各種調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，同時也是miRNA的結(jié)合位點。腫瘤相關的miRNA表達已被多項研究確定和分析，且不同的miRNA特征對于許多類型的癌癥，包括喉癌[2]。此外，依據(jù)細胞類型，人類惡性腫瘤中多個miRNA表達失調(diào)，表現(xiàn)出致癌或抑制腫瘤的特性。其中進化最保守的miRNA是miR-1，高度富集于心臟和肌肉，對祖細胞和成肌的增殖起重要作用。在這項研究中，我們喉癌患者血漿中miRNA表達及基于靶基因的能量消耗。

1材料與方法

1.1　一般資料

收集我院2013年12月至2014年6月收治的5例喉癌患者的病理組織。5例患者皆為男性，平均年齡(57±10.4)歲，年齡48～71歲。1例患者出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。2例接受不同范圍的喉部分切除術(shù),1例接受喉全切術(shù)，2例行電子喉鏡下病變組織活檢。3例病灶在聲門，2例在聲門上區(qū)。根據(jù)國際腫瘤協(xié)會(TNM)分期：1例為T3N0M1；2例為T3N0M0；2例為T1N0M0。

1.2　細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和RNA的隔離

入院后第2天清晨空腹抽血，血液標本收集后在超凈工作臺中進行以下操作，低溫高速離心機離心后吸取上層血漿轉(zhuǎn)移至無酶EP管中，放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人喉癌細胞系Hep2維持在RPMI 1640中，補充有10%胎牛血清(FBS)，青霉素100 IU/ml和100 μg/ml鏈霉素。細胞系保持在37 ℃的加濕室中補充5%CO2。用脂質(zhì)體2000試劑按照制造商的方案進行轉(zhuǎn)染。使用TRIzol試劑從HEp2細胞中提取所有RNA。

1.3　免疫組化法

篩取5對原發(fā)性喉鱗狀細胞癌組織和鄰近正常組織。4 ml組織切片進行抗原修復,121 ℃的微波組織相容處理器持續(xù)5 min。其次在3%過氧化氫阻斷過氧化物酶5 min，正常山羊血清蛋白阻斷10 min。

1.4　能量消耗評估

采用食物頻率問卷(FFQ)收集患者日常飲食頻率。同時進行營養(yǎng)生物標志物研究，記錄4天的飲食記錄(4DFR)進行飲食調(diào)整(DM)。應用雙標水(DLW)技術(shù)客觀測量短期總能量消耗，可用于能量消耗的校準(校正)和估計。每7天調(diào)查訪問1次，共2次。第一次訪問包括資格確認;知情同意書;身高和體重的測量； FFQ問卷和膳食補充劑等;收集血液和尿液標本。第二次訪問時，收集24 h尿標本和空腹血樣。2周的總能量消耗調(diào)查，從氧-18和氘的相對尿消除率估算。體重穩(wěn)定的人,客觀地估計2周總能耗。同樣，蛋白質(zhì)消耗通過6.25×24 h尿氮/0.81進行客觀估計。本研究獲得患者知情同意書及醫(yī)學倫理委員會批準。

1.5　統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用非配對t檢驗組間統(tǒng)計學顯著性差異。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1　miR-1抑制HEp2喉癌細胞的生長

為了研究miR-1對細胞表型的影響，我們首先提出了miR-1的表達構(gòu)建體pcDNA3/ Pri-miR-1，并確認了其效果。實時PCR結(jié)果顯示，與無轉(zhuǎn)染的喉癌細胞比較，在pcDNA3/ Pri-miR-1轉(zhuǎn)染的HEp2喉癌細胞中，miR-1水平升高了3.8倍。但是，miR-1在miR-1 ASO轉(zhuǎn)染的HEp2細胞中下降了70%。MTT分析評價細胞生存力。為了進一步確定miR-1對HEp2細胞生長的影響，進行了集落形成測試。pcDNA3/ Pri-miR-1轉(zhuǎn)染的HEp2細胞克隆形成率下降75%，miR-1 ASO轉(zhuǎn)染的HEp2細胞增加了近3倍，相對于各自的對照組。合成突變的miR-1，其中6個堿基發(fā)生突變，結(jié)果顯示突變的miR-1不影響HEp2喉癌細胞活力。這些結(jié)果表明了miR-1能夠促進HEp2細胞集落形成，但不影響細胞生存力，見圖1。

A、B分別為Pri-miR-1、miR-1 ASO轉(zhuǎn)染促進HEp2細胞中的miR-1表達；C、D分別為pcDNA3/ Pri-miR-1轉(zhuǎn)染的HEp2細胞克隆形

2.2　患者機體能量消耗變化及意義

根據(jù)能量消耗總量和脂肪密度的校準方程系數(shù)對患者能量消耗進行評估。由表1可見(DLW能量)線性回歸(自報能量)系數(shù)和標準差，并顯示了其他因素的影響。由表2可見，4DFR脂肪密度增加40%和4DFR總能量消耗增加20%時，是否采用能量標志物校準的風險比與控制BMI無差異。

表1　能量消耗總量和脂肪密度的消耗結(jié)果(系數(shù)，標準差)

注：SE為標準差。

表2　4DFR脂肪密度增加40%和4DFR總能量消耗增加20%的風險比

3　討論

3.1　miRNA參與葡萄糖代謝

微RNA(miRNA)是非編碼，18-24個核苷酸長度的RNA連接到靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)，從而改變基因表達[3]。世界第一例miRNA-LIN-4，及其目標基因lin-14是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的。自那時以來，大量的miRNA已經(jīng)確定，并從蠕蟲到哺乳動物都是高度保守的。代謝改變是癌癥的共同特征。通常情況下，非癌細胞通過氧化磷酸化的線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)分解代謝葡萄糖的。然而，即使在正常的氧存在下，增殖的癌細胞代謝葡萄糖顯著增加乳酸。這一現(xiàn)象被稱為 "Warburg效應" (沃伯格效應)。利用糖酵解提供能量，為癌細胞適應缺氧和酸性環(huán)境(乳酸生產(chǎn))提供了多種優(yōu)勢，助于癌細胞的侵襲和快速增殖。氧化應激和細胞中高水平的ROS(活性氧)在腫瘤形成了至關重要的作用。癌細胞使用丙酮酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)來對抗高氧化應激。因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA在癌癥細胞中表達異常，累積的研究表明，miRNA通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因，在腫瘤生長過程中起到重要的作用[4]。在過去的幾年里，大量的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)癌細胞的代謝。糖類，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸代謝都受到了miRNA的影響從而細胞的生長。正如“Warburg效應”所示，葡萄糖代謝的改變可導致癌細胞的增殖。其原因可以解釋為miRNA特定修改糖酵解途徑。大量研究報道m(xù)iRNA參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和葡萄糖轉(zhuǎn)運(GLUTs)。miRNA能夠通過調(diào)節(jié)癌組織中的一些GLUTs的表達從而控制葡萄糖的攝取。此外，楊等人報道，miR-21調(diào)控膀胱癌中的GLUT1和GLUT3的表達。此外，包括腎細胞癌的一項研究表明了miR-1291調(diào)節(jié)GLUT1的表達[5]。

3.2　miRNA參與脂類和氨基酸代謝

脂質(zhì)是合成細胞器和細胞的關鍵生物材料。改變脂質(zhì)代謝是癌癥代謝的獨特功能。多數(shù)的miRNA參與調(diào)節(jié)癌癥脂質(zhì)代謝。研究發(fā)現(xiàn)miR-122通過控制1-?；视?3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶1(Agpat1)的表達，以調(diào)節(jié)肝癌細胞的脂肪和膽固醇的代謝，細胞死亡誘導DFFA效應和相關脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白4(Stard4)[6]。研究已經(jīng)證實miR-185和miR-342在前列腺癌細胞通過減少固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的表達2(SREBP-2)和下調(diào)節(jié)它們的靶基因，包括脂肪酸合酶(FASN)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)，控制脂肪和膽固醇的生成[7]。最近，已經(jīng)證實了miR-205通過靶向?；?CoA合成酶長鏈家族成員1(ACSL1)，撤去調(diào)節(jié)肝細胞癌的脂代謝作用。miRNA調(diào)節(jié)氨基酸的分解代謝。Liu等報道了miR-32b調(diào)節(jié)腎癌脯氨酸氧化酶。這些研究表明，miRNA改變癌癥細胞中的脂質(zhì)和氨基酸代謝。

3.3　miRNA成為治療癌癥的目標基因

代謝改變在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要一步。針對癌癥代謝而開發(fā)的抗癌療法具有巨大潛力?，F(xiàn)有許多類型的化合物已被開發(fā)專門抑制腫瘤發(fā)展過程中的關鍵代謝酶。然而，某些細胞的代謝過程與癌癥細胞相似，如T淋巴細胞使用谷氨酰胺代謝[8]。研究表明，miRNA喪失調(diào)節(jié)功能，不影響正常細胞的生長，但顯著減少癌細胞生長。這表明，miRNA可以成為治療癌癥的新靶點。此外，腫瘤抑制基因p53誘導幾種miRNA，如miR-34，let-7，miR-107和miR-200，都參與調(diào)節(jié)LDHA，Myc和SIRT1的表達[9]。這些表明，P53/miR-34在腫瘤抑制中起著主要代謝調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)目標LDHA，Myc和SIRT1或其他代謝途徑或酶將成為癌癥治療的創(chuàng)新策略。miRNA可以作為抗癌治療目標和工具，然而，動物模型的發(fā)展，以及研究癌癥相關的miRNA和miRNA /抗miR的體內(nèi)遞送的有效性仍是一個主要的臨床研究障礙[10]。

綜上所述，miRNA是癌癥代謝的重要調(diào)節(jié)器。miRNA通過調(diào)節(jié)基因和酶的表達，參與糖酵解和能量代謝/途徑，從而控制癌癥的代謝。

參考文獻

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(編輯：甘艷)

Plasma-based miRNA Target Gene Expression and Energy Consumption in

Laryngeal Cancer

WUShuo,NIUJian,LILi,etal.FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150001

【Abstract】ObjectiveTo study the plasma-based miRNA target gene expression and energy consumption in laryngeal cancer.MethodsPathology tissues of 5 cases of laryngeal cancer were collected.Fasting blood,isolated from human laryngeal carcinoma cell line Hep2,all RNA were extracted from HEp2 cells.Food frequency questionnaire(FFQ)was used to collect the frequency of patients daily diet.Meanwhile nutritional biomarker studies,4-day diet records(4DFR)were recorded to conduct dietary adjustments(DM).ResultsReal-time PCR results showed that compared to non-transfected cells larynx in pcDNA3 / Pri-miR-1 transfected HEp2 laryngeal cancer cells,miR-1 levels increased by about 3.8 times.However,miR-1 reduced about 70% in miR-1 ASO transfected HEp2 cells.miR-1 could promote HEp2 cell colony formation,but did not affect cell viability.Energy consumption of patients showed that compared to control patients,the total energy consumption of fat and increased risk factors for laryngeal cancer patients were body mass index and age.ConclusionmiRNA can change lipid and amino acid metabolism of cancer cells;and miRNA may become a new target for cancer therapy.

【Key words】Laryngeal;miRNA;Energy consumption;Hazard ratio;Clinical treatment

中圖分類號：R739.65

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.006

通訊作者：曲學華

基金項目：作者單位:150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院

收稿日期(2015-02-06修回日期 2015-10-13)