活血通脈顆粒對頸動脈粥樣硬化兔TLR4信號通路及相關(guān)炎癥因子mRNA表達的影響

謝健　沈超　童曉云　李曉　石安華　陳文玲　葉勇　劉濤

摘要：目的 探討活血通脈顆粒干預(yù)頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）斑塊形成的機制及對炎癥因子表達的抑制作用。方法 將84只兔隨機抽取10只為空白組，其余采用高脂飼料喂養(yǎng)建立CAS模型。將成模48只CAS兔隨機分為模型組、自然消退組、辛伐他汀組和活血通脈低、中、高劑量組，每組8只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)5周。取頸動脈組織行常規(guī)HE染色觀察病理變化；免疫組化檢測兔頸動脈TLR4的活性表達；熒光定量PCR檢測各組TLR4及炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、核因子（NF）-κB mRNA表達。結(jié)果 模型組頸動脈內(nèi)膜明顯增厚，動脈粥樣硬化分布廣泛，斑塊內(nèi)含有大量泡沫細胞；免疫組化染色各給藥組TLR4陽性染色面積百分比明顯低于自然消退組（P<0.01）；活血通脈高劑量組與辛伐他汀組比較無明顯差異；熒光定量PCR檢測TLR4、NF-κB、MCP-1 mRNA表達各給藥組低于自然消退組（P<0.05）。結(jié)論 活血通脈顆?？赡芡ㄟ^TLR4信號通路干預(yù)CAS模型兔斑塊形成及對炎癥因子表達的抑制作用達到治療目的。

關(guān)鍵詞：活血通脈顆粒；頸動脈粥樣硬化；TLR4信號通路；單核細胞趨化蛋白-1；核因子-κB；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0047-04

Abstract： Objective To discuss the mechanism of rabbit plaque formation of carotid atherosclerosis （CAS） and inhibition of the expression of inflammatory factors. Methods Ten white rabbit randomly selected from 84 white rabbits were set as blank group， and the rest rabbits were fed with high-fat diet for the establishment of CAS models. 48 CAS model rabbits were randomly divided into model group， the natural healing group， simvastatin group， and Huoxue Tongmai Granule low-， medium- and high-dose groups， 8 rabbits in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage， once a day for 5 weeks. Carotid artery tissue routine HE staining was used to observe the pathological changes. Immunohistochemical detection was used for the activity of TLR4 expression in rabbit carotid artery. Fluorescence quantitative PCR was used to detect the TLR4 and the inflammation factor MCP-1， NF-κB mRNA expression. Results The rabbit endometria in model group were obvious thickening； atherosclerosis was widely distributed； a large number of foam cells in plaque were observed. Immunohistochemical in treatment groups showed that TLR4 positive staining area percentage significantly smaller than the natural healing group （P<0.01）. There were relatively few differences between Huoxue Tongma Granule high-dose group and simvastatin group. The expressions of TLR4， NF-κB， MCP-1 mRNA in the treatment group were lower than the natural healing group by Fluorescence quantitative PCR detection （P<0.05）. Conclusion Huoxue Tongmai Granules achieve therapeutical effect by intervening CAS rabbit plaque formation and inhibiting the expression of inflammatory factors through TLR4 signaling pathways.

Key words： Huoxue Tongmai Granules； carotid atherosclerosis； TLR4 signaling pathways； MCP-1； NF-κB； rabbits

隨著人口老齡化加快，頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）發(fā)病率不斷上升，炎癥反應(yīng)貫穿CAS發(fā)病的始終。臨床應(yīng)用活血通脈顆粒治療CAS，療效較好[1-2]，但其具體作用機制仍未明確。本實驗觀察活血通脈顆粒是否通過TLR4抑制炎癥因子，從而達到抑制炎癥反應(yīng)、延遲斑塊形成、穩(wěn)定斑塊、治療CAS的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物

活血通脈顆粒由紅景天、虎杖、三七粉、水蛭、茯苓、隔山消等組成，上述飲片均購于云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，并由該院制劑中心配制。辛伐他汀片，默沙東制藥有限公司，規(guī)格40 mg/片，批號K005133。

1.2 動物與飼料

健康新西蘭大白兔84只，雌雄不限，3～4月齡，體質(zhì)量（1.8±0.4）kg，昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，合格證號SCXK（滇）2011-0004。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院呈貢校區(qū)動物實驗中心，溫度20～26 ℃，濕度40%～60%。高脂飼料由84.5%基礎(chǔ)飼料中加入8%豬油、15%蛋黃粉、0.75%膽固醇組成。膽固醇購于安徽天啟公司（批號20140316），蛋黃粉購自同和生物公司（批號20130305）。

1.3 主要試劑與儀器

TLR4 Antibody、即用型SABC-POD（兔lgG）試劑盒、抗原修復(fù)液及DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix EX Taq?，Takara RNAiso Plus Reagent，Easy dilution，DEPC Free H2O，寶生物工程（大連）有限公司。CS-V1型攤片烤片機（Thermo公司），BM-Ⅷ生物組織包埋機（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），TS-12A生物組織自動脫水機、恒溫水浴箱（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），MilliPore超純水系統(tǒng)（北京醫(yī)療設(shè)備廠），AB204-S電子分析天平（Mettler-Toledo公司），DS-Fi2光學(xué)顯微鏡（Nikon公司），ABI2720 PCR儀、ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI），Genequant Ⅱ分光光度計（美國Pharmacia）。

1.4 分組、造模及給藥

實驗兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取10只為空白組，其余采用高脂飼料喂養(yǎng)建立CAS模型。造模過程中出現(xiàn)死亡，獲得成模兔48只。隨機分為模型組、自然消退組、辛伐他汀組和活血通脈低、中、高劑量組，每組8只。自然消退組、辛伐他汀組和活血通脈顆粒低、中、高劑量組以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)5周，每日灌胃1次，均自由飲水。根據(jù)臨床用藥劑量，參照常用實驗動物及人的體表面積比例[3]換算。辛伐他汀組每日給予辛伐他汀1.87 mg/kg灌胃，活血通脈低、中、高劑量組每日分別給予活血通脈顆粒5.5、11、22 g原藥材/kg灌胃，等體積蒸餾水加熱溶解。空白組、模型組和自然消退組予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)5周。

1.5 病理形態(tài)學(xué)觀察

運用空氣栓塞法處死動物，造模成功后及給藥5周后采集標本。采集頸動脈標本，肉眼觀察。再將10%中性緩沖甲醛液對標本灌注，固定24 h后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚5 μm），HE染色。每張切片隨機選取5個視野觀察組織病理改變。

1.6 免疫組化檢測

免疫組化檢測CAS斑塊中TLR4的表達。用微量移液器吸取一抗（兔多克隆抗體，1∶400）150 μL于組織切片上，放置濕盒中，4 ℃冰箱過夜，二抗（即用型SABC）滴加于組織切片上，SABC復(fù)合物工作液孵育，進行DAB顯色。細胞漿/細胞膜出現(xiàn)棕黃色沉著為TLR4陽性細胞。使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 Software測定，每張切片隨機選取5個視野，測定每個視野陽性反應(yīng)面積百分比（陽性面積÷視野面積×100%），取平均值表示陽性染色強度。

1.7 TLR4、單核細胞趨化蛋白-1和核因子-κB mRNA表達檢測

按照文獻[4]方法提取頸動脈組織總RNA。進行cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。經(jīng)Primer軟件驗證引物匹配度，用GAPDH作為參照基因，引物序列如下：TLR-4上游5'-GCCGAAAGGTGATTGTTGTGGTGT-3'，下游5-ACTGCCAGGTCTGAGCAATCTCAT-3'；NF-κB上游5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3'，下游5'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-3'；MCP-1上游5'-TGACCCCAAGCAGAAGT-3'，下游5'-TCC GGGTGGAAGATAAAT-3'；GAPDH上游5'-AGAGCA CCAGAGGAGGACG-3'，下游5'-TGGGATGGAAAC TGTGAAGAG-3'。引物長度均為125 bp。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green PCR master mix 12.5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，蒸餾水9.5 μL，cDNA 1 μL混合均勻。每個基因設(shè)5個梯度標準品及陰性對照，待測樣品2次重復(fù)反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min（預(yù)變性），94 ℃、30 s（變性），60 ℃、30 s（退火），72 ℃、45 s（延伸），共34個循環(huán)。實驗數(shù)據(jù)采用ABI7500 SDS Software分析，用公式2-ΔΔCt方法進行相對定量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多樣本組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊兩兩比較采用LSD法，方差不齊采用Dunnett's T3法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理觀察結(jié)果

空白組頸動脈管腔無明顯改變，內(nèi)膜完整光滑，未見泡沫細胞和硬化斑塊；模型組內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹小，內(nèi)皮細胞不連續(xù)，可見大量巨噬細胞/泡沫細胞。各給藥組較模型組內(nèi)膜細胞增生程度下降，斑塊內(nèi)含有較少的巨噬細胞/泡沫細胞，活血通脈顆粒高劑量組與辛伐他汀組差異不明顯。結(jié)果見圖1。

2.2 免疫組化染色活血通脈顆粒對兔頸動脈組織TLR4基因表達的影響

結(jié)果顯示，模型組較空白組細胞漿/細胞膜出現(xiàn)大量的棕黃色沉著，提示TLR4有強陽性表達。與自然消退組比較，各給藥組TLR4陽性染色面積減少（P<0.01），活血通脈高劑量組與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1、圖2。

2.3 熒光定量PCR檢測活血通脈顆粒對兔頸動脈組織TLR4、核因子-κB、單核細胞趨化蛋白-1 mRNA表達的影響

結(jié)果顯示，與自然消退組比較，各給藥組TLR4、NF-κB、MCP-1 mRNA表達水平降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

3 討論

單核細胞黏附并趨化遷入血管內(nèi)膜是動脈粥樣硬化形成的早期事件，而MCP-1是遷入血管內(nèi)膜的主要細胞因子。MCP-1使各種炎性細胞特別是單核細胞向病變部位聚集，并對炎癥因子的刺激做出應(yīng)答。同時，它還能活化白細胞并介導(dǎo)其產(chǎn)生炎性介質(zhì)，從而在動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS）的形成中發(fā)揮重要作用。因此，MCP-1被認為是很有潛力的反映AS早期改變與預(yù)后的生化指標。NF-κB是一種具多項轉(zhuǎn)錄作用的蛋白質(zhì)，它是多種信號的匯集點，在調(diào)控炎癥反應(yīng)的基因表達中起關(guān)鍵作用。它能調(diào)控促炎細胞因子、黏附分子和生長因子的表達，在炎癥和免疫反應(yīng)中起樞紐作用。由于NF-κB是炎癥的核心調(diào)節(jié)因子，動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)過程所涉及的許多基因都是由NF-κB激活的，因此認為，NF-κB激活可能是CAS發(fā)生發(fā)展的始動機制之一。

TLRs是一組Ⅰ型跨膜受體蛋白質(zhì)，通過與內(nèi)、外源性配體結(jié)合，激發(fā)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，啟動促炎因子的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要的作用。目前人類TLR家族有12名成員已被發(fā)現(xiàn)，其中人類血管內(nèi)皮細胞以表達TLR4為主，尚有少量TLR2；血管外膜的成纖維細胞有大量功能性TLR4，一旦活化能產(chǎn)生大量細胞因子。AS斑塊病變處的巨噬細胞和內(nèi)皮細胞也檢測到TLR4和TLR2的表達。TLR4識別內(nèi)外源性配體后，激活絲裂原激活蛋白激酶和NF-κB通路，啟動炎性應(yīng)答信號通路及誘導(dǎo)炎性因子表達而對機體組織產(chǎn)生保護或損傷作用。越來越多的證據(jù)表明，TLR4在AS發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用，TLR4可能是抗AS治療的新靶點[5]。如Bj?rkbacka等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TLR下游接頭蛋白MyD88缺陷可導(dǎo)致斑塊面積減少，脂質(zhì)濃度下降，細胞因子和化學(xué)因子如IL-12、MCP-1等促炎因子的表達下降，而且研究發(fā)現(xiàn)TLR4可直接干預(yù)巨噬細胞的膽固醇代謝，抑制巨噬細胞的膽固醇外溢，加速巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化，促進AS斑塊的形成。亦有研究發(fā)現(xiàn)在TLR和apoE雙缺陷小鼠模型實驗研究中發(fā)現(xiàn)模型小鼠主動脈粥樣硬化病變范圍下降了25%。TLR4激動介導(dǎo)的細胞因子和趨化因子產(chǎn)生增加能刺激細胞的遷移和細胞增殖[7]。Vink等[8]研究提示TLR4激動能促進富含平滑肌的內(nèi)膜形成，而內(nèi)膜平滑肌增殖是AS斑塊進展的基礎(chǔ)。

活血通脈湯是云南省名中醫(yī)趙淳教授治療血瘀證經(jīng)驗方。紅景天是活血通脈顆粒主要組成之一，其具有抗疲勞、延緩機體衰老、保護心腦血管等功效。沈氏等[9]研究表明，紅景天具有抑制AS形成，減少斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細胞生長因子表達和血管新生的作用?；⒄溶漳軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)血脂、保護血管內(nèi)皮、抑制內(nèi)皮細胞和血管平滑肌增殖等方面發(fā)揮抗AS的作用。水蛭有抗血凝、抗血栓形成，降低血液黏度、降血脂的功效。三七有止血、抗血栓、擴血管、抗動脈粥樣硬化等作用。

本實驗結(jié)果顯示，各給藥組兔頸動脈組織TLR4陽性染色面積百分比與自然消退組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），活血通脈顆粒高劑量組與辛伐他汀組比較無明顯差異。治療后各組家兔頸動脈組織中TLR4、NF-κB、MCP-1 mRNA表達的相對含量與自然消退組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。我們推測，活血通脈顆?？赡芡ㄟ^干預(yù)TLR4信號通路，抑制NF-κB、MCP-1表達，從而起到延遲斑塊形成、穩(wěn)定斑塊、治療CAS的目的。

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（收稿日期：2015-06-16；編輯：華強）