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肺炎鏈球菌實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展

劉美蓉1(綜述)，譚效鋒1，陳哲2*(審校)(1.天津醫(yī)院普內(nèi)科，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院保健醫(yī)療部，天津 300052)

[關(guān)鍵詞]肺炎球菌感染；診斷技術(shù)和方法；綜述文獻(xiàn)

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.034

在世界范圍內(nèi)，下呼吸道感染是感染性疾病的主要死亡原因[1]，但約40%社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)仍然病原不明確，致病原可能為肺炎鏈球菌[2-3]，分析其原因?yàn)椋孩俜窝祖溓蚓且环N苛養(yǎng)菌，可以產(chǎn)生自溶酶，送檢時(shí)間要求嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)室中普通培養(yǎng)基或涂片革蘭染色檢查可與草綠色鏈球菌混淆，培養(yǎng)和菌種菌型鑒別過程復(fù)雜，導(dǎo)致診斷率降低；②社區(qū)感染患者住院率低，因培養(yǎng)檢查時(shí)間長，門診留取標(biāo)本培養(yǎng)比例也低[4]，同時(shí)早期抗生素的應(yīng)用降低了血及胸腔積液培養(yǎng)的陽性率；③由于侵入性診斷技術(shù)的應(yīng)用局限，人為因素導(dǎo)致痰標(biāo)本的合格率低。所以，臨床診斷肺炎鏈球菌性肺炎目前存在一定困難，易導(dǎo)致誤診延誤治療，尤其在患者出現(xiàn)耐藥肺炎鏈球菌感染時(shí)。因此，一些新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法應(yīng)運(yùn)而生，如免疫層析法(immunochromatographic test，ICT)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、乳膠顆粒凝集試驗(yàn)(latex particle agg lutination test，LPAT)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等。近年研究顯示ICT尿肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)可以明顯提高臨床診斷率[5-9]?，F(xiàn)就肺炎鏈球菌的病原學(xué)特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述如下。

1肺炎鏈球菌的病原學(xué)特點(diǎn)

1.1形態(tài)特征肺炎鏈球菌簡稱肺炎球菌，舊稱肺炎雙球菌，是痰液中分離出的，革蘭染色陽性，電鏡下可見菌體似矛頭狀，涂片檢查成雙或成短鏈狀排列的雙球菌。

1.2致病機(jī)制除了細(xì)菌莢膜是肺炎鏈球菌的主要毒力因子，溶血素和神經(jīng)氨酸酶也是致病物質(zhì)。肺炎鏈球菌可以通過表面蛋白和人類鼻咽部上皮細(xì)胞表面受體相互作用而使細(xì)菌黏附于細(xì)胞。在呼吸道上皮層無損傷時(shí)，細(xì)菌可定植于呼吸道黏膜，與人處于共生狀態(tài)，無致病性[10-11]。近年研究顯示，不同人群上呼吸道攜帶此菌的比例有差別，如兒童高于成人[12]，低收入國家人群高于發(fā)達(dá)國家人群等[13]。當(dāng)上呼吸道黏膜防御功能及正常肺部清除機(jī)制受損時(shí)易引發(fā)疾病，如炎性反應(yīng)后上呼吸道黏膜損傷、慢性肺部結(jié)構(gòu)病變等。該菌主要引起人類的肺炎，以大葉性實(shí)變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，也可以表現(xiàn)為小葉性肺炎，其次是支氣管炎。肺炎鏈球菌引起肺炎后可繼發(fā)中耳炎、乳突炎、肺膿腫、腦膜炎和敗血癥等。

1.3耐藥性肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥機(jī)制是由青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding protein,PBP)-1a、PBP-2a、PBP-2b、PBP-2x質(zhì)量和數(shù)量突變所引起的。對(duì)青霉素耐藥的菌株對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性也會(huì)降低。對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌常表現(xiàn)出多重耐藥，如四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類和磺胺異噁唑等藥物，目前肺炎鏈球菌對(duì)氟喹諾酮類仍保持敏感，耐藥菌株相對(duì)較少。肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥主要通過2種機(jī)制：①由erm介導(dǎo)的核糖體甲基化和由mef介導(dǎo)的外排泵系統(tǒng)；②有少數(shù)菌株由于核糖體突變導(dǎo)致耐藥[10]。不但青霉素耐藥的肺炎鏈球菌發(fā)生率在我國不同地區(qū)有較大差異，對(duì)青霉素不敏感菌株(penicillin is not sensitive strains of streptococcus pneumoniae，PNSSP)的比例也有差異。兒童感染PNSSP的機(jī)會(huì)要大于成人。有研究顯示急性呼吸道感染患兒細(xì)菌性因素中肺炎鏈球菌占有比例最高約12.0%，并且200株肺炎鏈球菌中,耐青霉素的肺炎鏈球菌有182株(91.0%)[14]。肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率甚至可達(dá)到96%[4]。劉又寧等[15]研究顯示，我國導(dǎo)致CAP的肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率達(dá)75.0%以上,對(duì)青霉素的不敏感率為20.3%。國內(nèi)相近文獻(xiàn)也報(bào)道452例CAP患者中明確病原體感染者187例，其中41株肺炎鏈球菌有產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰酶18株(43.9%)[16]。不僅肺炎鏈球菌在下呼吸道感染中耐藥性較高，在皮膚感染中也具有很高的耐藥性，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道大面積燒傷患者皮膚感染來源的肺炎鏈球菌氨曲南、阿米卡星、美洛培南的耐藥性較高，分別為85.4%、90.6%和76.9%[17]。

1.4致病性感染耐藥肺炎鏈球菌后會(huì)加重患者的病情程度，增加預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。耐藥肺炎鏈球菌感染的危險(xiǎn)因素包括：①年齡>65歲或<2歲；②3個(gè)月內(nèi)曾用β-內(nèi)酰胺類抗生素；③酗酒；④內(nèi)科慢性疾病(包括慢性心、肺、肝、腎疾病，糖尿病，惡性腫瘤，脾臟缺如，免疫抑制性疾病)；⑤免疫抑制狀態(tài)(疾病所致或使用免疫抑制劑治療的)；⑥接觸過托幼所的兒童。所以據(jù)統(tǒng)計(jì)是否存在敗血癥、年齡和潛在性基礎(chǔ)疾病等因素肺炎球菌性肺炎的病死率有時(shí)甚至可高達(dá)30%[2-18]。另外，引起重癥肺炎最多的病原體也是肺炎鏈球菌，其特定的基因型感染人后可產(chǎn)生大量內(nèi)毒素而引起嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，因此導(dǎo)致重癥肺炎患者的病死率增高[19]。

2肺炎鏈球菌的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法

2.1肺炎鏈球菌的培養(yǎng)可作為培養(yǎng)的標(biāo)本包括痰液、膿液、血液、腦脊液、肺泡灌洗液等標(biāo)本，其中合格痰的標(biāo)準(zhǔn)是革蘭染色顯微鏡下鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍鏡視野、多核白細(xì)胞>25個(gè)/低倍鏡視野，或二者比例<1∶2.5。合格的痰標(biāo)本再進(jìn)一步培養(yǎng)鑒定。典型的肺炎鏈球菌鏡檢革蘭染色涂片為陽性球菌，菌體呈矛頭狀成雙排列，坦面相鄰，尖端向外，有時(shí)可以診斷；肺炎鏈球菌正常生長營養(yǎng)要求較高，為苛養(yǎng)菌，在普通培養(yǎng)基上生長不良，容易誤認(rèn)為草綠色鏈球菌，在含血液或血清的培養(yǎng)基上才能生長，所以分離培養(yǎng)常采用羊血平板，并且有助于其溶血特征的識(shí)別和進(jìn)一步鑒定。在血平板上，肺炎鏈球菌的菌落呈灰白色、半透明狀，直徑0.5～1.5 mm，菌落表面光滑扁平狀，也有菌株可表現(xiàn)為黏液狀，菌落周圍可見環(huán)繞著草綠色溶血環(huán)。因該菌可產(chǎn)生自溶酶，培養(yǎng)或放置24 h以上的培養(yǎng)物還會(huì)由于肺炎鏈球菌的自溶作用而使菌落中央塌陷邊緣隆起，呈臍窩狀，是一種典型的形態(tài)表現(xiàn)。肺炎鏈球菌還有一個(gè)特點(diǎn)就是經(jīng)人工培養(yǎng)后莢膜逐步消失[20]。

2.2肺炎鏈球菌菌種的鑒定實(shí)驗(yàn)該菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈綠色，易與草綠色鏈球菌混淆，所以實(shí)驗(yàn)室常采用以下常規(guī)鑒定方法。①膽汁溶菌試驗(yàn)：該試驗(yàn)的原理是基于膽鹽能夠通過活化肺炎鏈球菌的自溶酶而溶解肺炎鏈球菌，但它不能溶解草綠色鏈球菌。常用的方法包括試管法、平板法和玻片法等。其中試管法更為常用，具體操作是取2滴10%去氧膽酸鈉溶液加入在1 mL待鑒定菌的18～24 h培養(yǎng)液中，于35 ℃下孵育5~10 min后進(jìn)行鑒定，菌管內(nèi)液體由混濁變?yōu)橥该髡邽殛栃裕羧詼啙釣殛幮?；平板法是取一個(gè)接種環(huán)，取2%去氧膽酸鈉溶液加于血平板待鑒定菌的菌落上，于35 ℃下孵育15～30 min，菌落溶解消失者為陽性，未消失或未完全消失者為陰性；最后玻片法是分別取1滴血培養(yǎng)液加至2張玻片上，在其中1張玻片上加入1滴10%去氧膽酸鈉，在另一張玻片上加入1滴生理鹽水，予以自然干燥處理，干燥后進(jìn)行革蘭染色，再油鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)球菌完全被溶解，而對(duì)照玻片上顯示細(xì)菌完全未溶解或部分溶解為陽性結(jié)果[18]。②奧普托欣試驗(yàn)：也是與其他草綠色鏈球菌相鑒別的手段。具體方法是用接種環(huán)將單個(gè)待鑒定菌落均勻涂于血平板上，用含量為5 μg的奧普托欣紙片貼于接種區(qū)中央，在35 ℃下行需氧培養(yǎng)，并過一夜后觀察，如果抑菌圈>18 mm為陽性。

2.3肺炎鏈球菌菌型鑒定一些特殊血清型的肺炎鏈球菌(如血清型3和37)生長形態(tài)不典型，需要做進(jìn)一步菌型鑒別，常用的方法有：①莢膜腫脹試驗(yàn)也稱為Quellung試驗(yàn)，用新鮮的標(biāo)本懸液與等量不稀釋的肺炎球菌分型診斷血清混合后，覆以蓋玻片，在油鏡下觀察，標(biāo)本中肺炎球菌若與同型免疫血清相遇，其莢膜將顯著增大。②凝集試驗(yàn)，將可疑肺炎球菌與已知標(biāo)準(zhǔn)分型的血清作玻片凝集試驗(yàn)，若細(xì)菌凝集成堆，則為同型肺炎球菌。

3肺炎鏈球菌的實(shí)驗(yàn)室新近診斷方法

以上傳統(tǒng)培養(yǎng)方法要求實(shí)驗(yàn)室具備一定的條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求高，但因試驗(yàn)步驟繁多，不確定因素較多，故而試驗(yàn)敏感性差，并且獲得檢驗(yàn)結(jié)果需要時(shí)間長，為臨床肺炎鏈球菌感染的診斷帶來困難，所以近年來一些快速簡便敏感性較高的檢測(cè)方法逐漸顯現(xiàn)優(yōu)勢(shì)。

3.1ICTICT是一種檢測(cè)肺炎鏈球菌可溶性抗原的快速方法,目前在我國尚未廣泛應(yīng)用于臨床。其檢測(cè)抗原為C-polysaccharide(PnC)抗原,位于細(xì)菌細(xì)胞壁的C多糖中,為肺炎球菌各血清型所共有。由于ICT以尿樣作為檢測(cè)對(duì)象,所以又稱尿抗原檢測(cè)法。美國Binax,Inc公司生產(chǎn)Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test試劑盒目前在國外應(yīng)用較為廣泛，并有較多文獻(xiàn)研究其敏感性、特異性。Binax NOW試劑的臨床敏感性和特異性，在美國多家機(jī)構(gòu)及中心進(jìn)行了較大樣本的研究。其中包括回顧性研究和前瞻性研究，回顧性研究用標(biāo)準(zhǔn)方法推算Binax NOW試驗(yàn)性能，敏感性是86%、特異性為94%、總準(zhǔn)確度是93%，95%可信區(qū)間分別是71%~94%、91%~96%、90%~95%。前瞻性研究用Binax NOW試驗(yàn)對(duì)住院患者和門診患者進(jìn)行了同等測(cè)試，門診性能：敏感性90%、特異性78%、準(zhǔn)確度80%，95%可信區(qū)間分別是70%~97%、70%~85%、72%~86%。住院性能：敏感性90%、特異性71%、準(zhǔn)確度73%，95%可信區(qū)間分別是60%~98%、59%~80%、62%~82%。該試劑敏感性能數(shù)據(jù)指標(biāo)還作出血清型評(píng)估：代表23個(gè)肺炎鏈球菌血清型的44株分離菌株引起了美國乃至全世界90%以上肺炎球菌感染。它們都在培養(yǎng)基上生長且在105細(xì)胞/mL時(shí)Binax NOW試驗(yàn)陽性。尿液檢測(cè)限把1∶250稀釋度作為Binax NOW試驗(yàn)的檢測(cè)限。該試劑交叉反應(yīng)性指標(biāo)尿液檢測(cè)回顧性研究中從338位陰性患者中分離出270種微生物，當(dāng)用純培養(yǎng)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這些微生物在Binax NOW試驗(yàn)中均未產(chǎn)生交叉反應(yīng)性。全微生物檢測(cè)為了確定Binax NOW試驗(yàn)的分析特異性，收集了144份交叉反應(yīng)物，包括與肺炎有關(guān)的微生物和可能作為正常菌群在泌尿生殖道發(fā)現(xiàn)的微生物，以及引起尿道感染的微生物。所有微生物都在106~109CFU/mL用Binax NOW試驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)估，在144例微生物中有143例無交叉反應(yīng)性，唯一陽性的微生物是緩和鏈球菌，由于它和Binax NOW試驗(yàn)有共同抗原，交叉反應(yīng)是可預(yù)期的。干擾物質(zhì)檢測(cè)用Binax NOW肺炎鏈球菌試驗(yàn)對(duì)白細(xì)胞數(shù)(每低倍鏡視野的數(shù)量)、紅細(xì)胞數(shù)(每低倍鏡視野的數(shù)量)、蛋白(5 g/L)、糖(>20 g/L)、混濁度升高的尿液標(biāo)本進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)性能沒有造成影響。重復(fù)性研究分別在3家床邊護(hù)理機(jī)構(gòu)用一組含陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性的單盲編碼標(biāo)本對(duì)Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)進(jìn)行單盲研究。含有硼酸和不含硼酸的樣本都進(jìn)行了測(cè)試。參與者在3 d內(nèi)對(duì)每一標(biāo)本進(jìn)行多次測(cè)試。359份測(cè)試標(biāo)本中有357份(99.4%)產(chǎn)生了預(yù)期結(jié)果。此試劑盒在成人診斷中有較好的敏感性和特異性,而在兒童中特異性差異較大，可以作為診斷成人肺炎球菌性CAP的有效方法之一。Monno等[21]選取2007年1月—2012年2月1 414例CAP患者做的回顧性研究顯示，該方法敏感性高于痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)。Genné等[5]選取67例CAP成年患者與81例健康者作對(duì)照后獲得尿肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)試劑的敏感性為64.3%，特異性為98.8%。

但Binax NOW檢驗(yàn)方法有一定的局限性：①Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)僅用尿液和腦脊液標(biāo)本驗(yàn)證過，其他可能含有肺炎鏈球菌抗原的標(biāo)本(如血漿或其他體液)尚未進(jìn)行過評(píng)價(jià)。②Binax NOW試驗(yàn)陰性不能排除肺炎鏈球菌感染，因此應(yīng)與培養(yǎng)結(jié)果、血清學(xué)或其他抗原檢測(cè)方法學(xué)結(jié)合作出準(zhǔn)確診斷。③未對(duì)服用抗生素超過24 h的患者或新近完成抗菌治療的患者用Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)進(jìn)行過評(píng)價(jià)，也未對(duì)非處方藥對(duì)肺炎球菌性腦膜炎患者的影響進(jìn)行確定。④使用肺炎鏈球菌疫苗后48 h內(nèi)可能對(duì)尿液中 Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)造成假陽性結(jié)果。疫苗對(duì)肺炎球菌腦膜炎患者的影響未做確定。因此，建議使用肺炎鏈球菌疫苗后5 d內(nèi)不要進(jìn)行Binax NOW肺炎鏈球菌檢測(cè)。⑤Binax NOW試驗(yàn)對(duì)小兒尿液的準(zhǔn)確性還未得到證實(shí)，另對(duì)小兒腦脊液的性能已得到了證實(shí)。

3.2ELISAELISA特異性好,敏感性高,是具有較好應(yīng)用前景的方法之一。采用ELISA 檢測(cè)尿樣中完整形態(tài)的肺炎球菌溶血素分子，與ICT相比有相似的敏感性[22]，但操作方法與結(jié)果獲得不如ICT方便快捷。

3.3LPATLPAT操作簡便、結(jié)果快速,是較早用于檢測(cè)肺炎球菌的血清學(xué)方法，但LPAT存在較多假陽性結(jié)果,結(jié)果分析帶有主觀性,其檢測(cè)的PCA抗原為特異型抗原,檢測(cè)不同血清型肺炎球菌需要不同抗體,而ICT檢測(cè)的PnC 抗原為各血清型所共有。因此,與ICT 相比,LPAT 還存在局限性,不能用于肺炎球菌各血清型的檢測(cè)[9]。

3.4PCRPCR敏感性高、特異性強(qiáng),特別是實(shí)時(shí)定量PCR方法。實(shí)時(shí)定量PCR 可重復(fù)定量檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù),對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,從而增加了PCR特異性和敏感性。但是與ICT相比,PCR仍是一種相對(duì)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的檢測(cè)方法,全過程需10 h左右,還未完全標(biāo)準(zhǔn)化,因而尚未成為肺炎球菌的臨床診斷方法,主要作為實(shí)驗(yàn)室研究的技術(shù)方法[9]。

此外，還有環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)痰標(biāo)本肺炎鏈球菌的方法[23]，血液中肺炎鏈球菌的建立擴(kuò)增片段長度多態(tài)性快速檢測(cè)方法等[24]。近年來Sawa等[25]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，抗體檢測(cè)核糖體蛋白L7/L12有可能成為一種新的有發(fā)展前景的檢測(cè)手段；Hotomi等[26]提出ODK-0901多克隆抗體檢測(cè)肺炎鏈球菌引起的急性中耳炎和急性鼻竇炎比肺炎鏈球菌尿抗原檢測(cè)更有價(jià)值，尤其對(duì)于兒童患者。

4結(jié)語

肺炎鏈球菌檢測(cè)有諸多方法，但就其快速、簡單的特性首選是ICT，在各國臨床醫(yī)生工作和研究中尿肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)已十分普及，該檢測(cè)手段與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)比較有更高的敏感性和特異性[5]；同時(shí)為臨床醫(yī)師選擇抗生素提供了良好地依據(jù)，減少了患者的診治費(fèi)用。目前由于抗生素的不規(guī)范使用，臨床醫(yī)生初次診治CAP患者時(shí)其多已使用一種或多種抗生素，所以使用抗生素后對(duì)肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)敏感性的影響尚需進(jìn)一步研究，以便為臨床醫(yī)生檢測(cè)患者時(shí)提供可靠依據(jù)，提高肺炎鏈球菌性肺炎的診斷率。

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(本文編輯：趙麗潔)

·綜述·

[中圖分類號(hào)]R515.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)02-235-05

通訊作者*。E-mail:tjzyycz@sina.com

[作者簡介]劉美蓉(1978-)，女，河北景縣人，天津醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事普內(nèi)科疾病診治研究。

[收稿日期]2014-06-04；[修回日期]2014-06-24