曲格列酮對腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的作用及其機(jī)制

丁紅，王蕾，李慧敏

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032)

·論 著·

曲格列酮對腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的作用及其機(jī)制

丁紅，王蕾，李慧敏

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032)

目的 探討曲格列酮對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞分為空白組，TNF-α組、TNF-α+曲格列酮組，MTT法檢測各組系膜細(xì)胞的增殖情況，ELISA法測定各組系膜細(xì)胞上清液中細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)蛋白表達(dá)，免疫組化法測定各組系膜細(xì)胞核因子κB(NF-κB)的表達(dá)情況。結(jié)果TNFα組腎小球系膜細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h增殖的OD值分別為(0.198± 0.025)、(0.241±0.028)、(0.286±0.030)、(0.267±0.042)，空白組分別為(0.159±0.021)、(0.161±0.019)、(0.164±0.023)、(0.170±0.020)，TTNF-α+曲格列酮組分別為(0.187±0.023)、(0.184±0.017)、(0.172±0.018)、(0.168±0.026)，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞增殖的OD值明顯高于空白組，TNF-α+曲格列酮組明顯低于TNF-α組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率為(62.34±10.26)%，空白組為(29.97±4.88)%，TNF-α+曲格列酮組為(45.67±8.36)%，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率明顯高于空白組，而TNF-α+曲格列酮組則明顯低于TNF a組，高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度為(967.8±77.4)pg/mL，空白組為(571.2±69.6)pg/mL，TNFα+曲格列酮組為(787.5±81.2)pg/mL，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度明顯高于空白組，TNF-α+曲格列酮組明顯低于TNF-α組，但仍高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論TNF-α能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表達(dá)，曲格列酮能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，降低NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表達(dá)。

曲格列酮；腫瘤壞死因子α；腎小球系膜細(xì)胞；增殖

腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，考慮其發(fā)病主要和機(jī)體免疫功能異常有關(guān)，包括體液免疫、細(xì)胞免疫、自身免疫，以及補(bǔ)體的激活和炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1等多種炎癥因子在腎小球腎炎的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]，過氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)有α、β、γ 3個亞型，PPARγ能夠抑制炎癥反應(yīng)，阻止腎小球硬化，PPARγ有多種配體，曲格列酮是具有代表性的PPARγ合成配體，曲格列酮具有抗炎作用[2-3]。本研究觀察TNF-α及曲格列酮對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況、核因子(nuclear factor κB，NF-κB)及細(xì)胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討曲格列酮對腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 大鼠腎小球系膜細(xì)胞系(RGMC，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，腫瘤壞死因子-α(上?；~生物科技有限公司)、ELISA試劑盒(杭州博日科技有限公司)、免疫組化試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，抗NF-κB抗體(美國Santa Cruz公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Cainelius公司)、酶標(biāo)儀(美國Cainelius公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng) 腎小球系膜細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%以上融合時，胰蛋白酶消化，制成系膜細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的測定 系膜細(xì)胞接種到96孔板中，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將培養(yǎng)細(xì)胞分為3組：空白組，TNF-α組、TNF-α+曲格列酮組，空白組加入RPMI-1640培養(yǎng)液，TNF-α組加入20 ng/mLTNF-α，TNF-α+曲格列酮組加入20 ng/mL腫瘤壞死因子和15 μmol/L曲格列酮，每組設(shè)8各孔，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h，培養(yǎng)終止前加入噻唑藍(lán)(MTT)，孵育4 h，加入DMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定系膜細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 系膜細(xì)胞NF-κB表達(dá)的測定 采用免疫組化法測定系膜細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，將細(xì)胞接種到放置玻片的24孔板中，按照上述分組，每組6孔，培養(yǎng)24 h取出玻片，丙酮固定細(xì)胞，免疫組化法測定NF-κB蛋白陽性細(xì)胞率。

1.2.4 系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)測定系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白，細(xì)胞消化后接種到24孔板中，按上述方法進(jìn)行分組，每組6孔，培養(yǎng)24 h后收集上清液，根據(jù)ELISA說明書進(jìn)行系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的測定。

1.3 主要觀察指標(biāo) 各組系膜細(xì)胞的增殖情況、NF-κB的表達(dá)情況和ICAM-1蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組系膜細(xì)胞的增殖情況 TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h的增殖與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；腫TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h的增殖與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞12 h、24 h和48 h的增殖分與TNF-α組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組系膜細(xì)胞的增殖情況(±s)

表1 各組系膜細(xì)胞的增殖情況(±s)

注：與空白組比較，aP＜0.05，與TNF-α組比較，bP＜0.05。

組別空白組TNF-α組TNF-α+曲格列酮組F值P值6 h 0.159±0.021 0.198±0.025a0.187±0.023 17.264 0.000 12 h 0.161±0.019 0.241±0.028a0.184±0.017b36.264 0.000 24 h 0.203±0.016 0.286±0.030a0.172±0.018b89.014 0.000 48 h 0.170±0.020 0.267±0.042a0.168±0.026b145.264 0.000

2.2 各組系膜細(xì)胞NF-κB的表達(dá)情況 TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率與TNF-α組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組系膜細(xì)胞NF-κB的表達(dá)情況(±s)

表2 各組系膜細(xì)胞NF-κB的表達(dá)情況(±s)

注：與空白組比較，aP＜0.05，與TNF-α組比較，bP＜0.05。

組別NF-κB蛋白陽性率(%)空白組TNF-α組TNF-α+曲格列酮組F值P值29.97±4.88 62.34±10.26a45.67±8.36ab17.354 0.000

2.3 各組系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)情況比較 TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度與TNF-α組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

組別空白組TNF-α組TNF-α+曲格列酮組F值P值ICAM-1蛋白濃度(pg/mL) 571.2±69.6 967.8±77.4a787.5±81.2ab14.582 0.000

3 討 論

腎小球腎炎的發(fā)病和機(jī)體的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)，抗炎因子血小板衍生生長因子、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、TNF-α和轉(zhuǎn)化生長因子-β等均參與腎小球腎炎的發(fā)展[4]。TNF-α在某些因素的刺激下產(chǎn)生，是重要的炎性因子[5]。NF-κB是Bcl家族成員之一，位于有核細(xì)胞內(nèi)，對多種基因轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用，在胞漿中和IκB結(jié)合以非活性形式存在，對腎小球系膜細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和系膜細(xì)胞的增殖具有調(diào)控作用[6-7]。ICAM-1能夠識別巨噬細(xì)胞抗原和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1，促進(jìn)表達(dá)ICAM-1的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞黏附，浸潤到炎癥部位，參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，在正常腎臟中，ICAM-1表達(dá)水平比較低，在腎小球腎炎等疾病中ICAM-1的表達(dá)明顯升高，ICAM-1在腎臟疾病的炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用[8]。本研究用TNF-α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞，觀察系膜細(xì)胞的增殖情況、NF-κB的表達(dá)情況和ICAM-1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h的增殖明顯高于空白組，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率明顯高于空白組，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度明顯高于空白組。這表明TNF-α誘導(dǎo)能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞生長，促進(jìn)NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表達(dá)。在腎小球腎炎的發(fā)展過程中，局部產(chǎn)生的TNF-α能夠刺激系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)增加，引起炎癥細(xì)胞浸潤，加重炎癥反應(yīng)，ICAM-1蛋白的表達(dá)增強(qiáng)引起白細(xì)胞遷移和聚集，引起腎臟炎癥反應(yīng)。TNF-α促進(jìn)系膜細(xì)胞NF-κB的活化，上調(diào)ICAM-1的表達(dá)，通過NF-κB調(diào)控系膜細(xì)胞炎癥因子和系膜細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)腎小球腎炎的發(fā)展。

腎小球腎炎的發(fā)病與機(jī)體的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)，抗炎因子血小板衍生生長因子、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和轉(zhuǎn)化生長因子-β等均參與腎小球腎炎的發(fā)展[4]，其中腫瘤壞死因子-α是重要的炎性因子[5]。NF-κB存在于有核細(xì)胞內(nèi)，對多種基因轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用，在胞漿中可以和IκB結(jié)合，以非活性形式存在，對腎小球系膜細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和系膜細(xì)胞的增殖具有調(diào)控作用[6-7]。ICAM-1能夠識別巨噬細(xì)胞抗原和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1，促進(jìn)表達(dá)ICAM-1的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞黏附，浸潤到炎癥部位，參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，在正常腎臟中，ICAM-1表達(dá)水平比較低，在腎小球腎炎等疾病中ICAM-1的表達(dá)明顯升高，表明ICAM-1在腎臟疾病的炎癥損傷過程中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究利用TNF-α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞，觀察系膜細(xì)胞的增殖情況、NF-κB的表達(dá)情況和ICAM-1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h的增殖明顯高于空白組，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率明顯高于空白組，TNF-α組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度明顯高于空白組。表明TNF-α誘導(dǎo)能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞生長，促進(jìn)NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表達(dá)。在腎小球腎炎的發(fā)展過程中，局部產(chǎn)生的TNF-α能夠引起系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)增加，引起炎癥細(xì)胞浸潤，加重炎癥反應(yīng)，而ICAM-1蛋白表達(dá)的增強(qiáng)則會引起白細(xì)胞遷移和聚集，導(dǎo)致腎臟炎癥。

PPARγ多數(shù)分布在集合管遠(yuǎn)端，在腎臟微血管和腎小球中表達(dá)比較少，PPARγ能夠降低血糖，調(diào)節(jié)脂肪代謝，抑制炎癥反應(yīng)，抑制腎小球硬化，具有保護(hù)腎臟的作用[9]，PPARγ有多種激動劑和配體，合成配體的代表藥物為曲格列酮，PPARγ在多種炎癥細(xì)胞中均有表達(dá)，經(jīng)配體活化后能夠抑制NF-κB，降低腫瘤壞死因子等多種炎癥因子的抗炎效應(yīng)，抑制系膜細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞外基質(zhì)減少[10-11]。本研究通過對PPARγ配體曲格列酮對TNF-α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞，觀察系膜細(xì)胞的增殖情況、NF-κB的表達(dá)情況和ICAM-1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞12 h、24 h和48 h的增殖明顯低于TNF-α組，腎小球系膜細(xì)胞NF-κB蛋白陽性率亦明顯低于TNF-α組，但高于空白組，TNF-α+曲格列酮組腎小球系膜細(xì)胞ICAM-1蛋白濃度明顯低于TNF-α組，高于空白組。這表明曲格列酮能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞生長，降低NF-κB蛋白的活性及ICAM-1的表達(dá)，在腎小球腎炎的發(fā)展過程中起到對腎臟的保護(hù)作用。

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Effect of troglitazone on tumor necrosis factor-α induced mesangial cells and its mechanism.

DING Hong,WANG Lei,LI Hui-min.Department of Nephrology,the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110032, Liaoning,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of troglitazone on TNF-α induced mesangial cells and its mechanism.MethodsThe cultured mouse glomerular mesangial cells were divided into the blank group,TNF-α group, TNF-α+troglitazone group.The proliferation of mesangial cells was detected by MTT assay.The expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)protein in the supernatants of mesangial cells was determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The expression of nuclear factor-κB(NF-κB)in mesangial cells of different groups was determined by immunohistochemistry.ResultsThe proliferation OD values of the glomerular mesangial cells in the TNF-α group at 6 hours,12 hours,24 hours and 48 hours were(0.198±0.025),(0.241±0.028),(0.286±0.030),and (0.267±0.042),respectively;the proliferation OD values of the glomerular mesangial cells in the blank group were (0.159±0.021),(0.161±0.019),(0.164±0.023)and(0.170±0.020),respectively;the proliferation OD values of the glomerular mesangial cells in the TNF-α+troglitazone group were(0.187±0.023),(0.184±0.017),(0.172±0.018)and (0.168±0.026),respectively.The proliferation OD values of the glomerular mesangial cells of the TNF-α group were significantly higher than those of the blank group,and the OD values of glomerular mesangial cell proliferation of the TNF-α+troglitazone group were significantly lower than those of the TNF-α group,with statistically significant differences(P＜0.05).The positive rate of NF-κB protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α group,blank group and TNF-α+troglitazone group were respectively(62.34±10.26)%,(29.97±4.88)%and(45.67±8.36)%;the positive rate of NF-κB protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α group was significantly higher than that in the blank group; the positive rate of NF-κB protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α+troglitazone group was significantly lower than that in TNF-α group and significantly higher than that in blank group,and all of the above differences were statistically significant(P＜0.05).The concentration of ICAM-1 protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α group,blank group and TNF-α+troglitazone group were respectively(967.8±77.4)pg/mL,(571.2±69.6)pg/mL and (787.5±81.2)pg/mL;the concentration of ICAM-1 protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α group was significantly higher than that in blank group;the concentration of ICAM-1 protein in glomerular mesangial cells in the TNF-α+ troglitazone group was significantly lower than that in TNF-α group and significantly higher than that in blank group,and all of the above differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionTNF-α can promote the proliferation of glomerular mesangial cells and the expression of NF-κB protein and ICAM-1 protein,while troglitazone can inhibit the proliferation of glomerular mesangial cells and decrease the expression of NF-κB protein and ICAM-1 protein.

Troglitazone;Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Mesangial cells;Proliferation

R692

A

1003—6350（2016）24—3957—04

2016-07-19)

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計劃項(xiàng)目(編號：2012225021)

丁紅。E-mail：dinghong1230123@sina.com