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循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)研究進(jìn)展

張國瑞1張忠獻(xiàn)2曹風(fēng)雨2劉紅1楊曉樂1張業(yè)鵬1

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥二科二病區(qū)河南 鄭州450052； 2.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河南 鄭州450001)

【關(guān)鍵詞】循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測；腫瘤

2015年2月4日，CA期刊在線發(fā)布了《2012全球癌癥統(tǒng)計(jì)》的全文?；贕LOBOCAN估計(jì)，2012年全球有1.41千萬新發(fā)癌癥病例，820萬患者死于癌癥。其中57%的癌癥患者以及65%的癌癥死亡患者來自于發(fā)展中國家。根據(jù)對(duì)全國腫瘤登記中心2011年監(jiān)測數(shù)據(jù)分析，中國腫瘤登記中心2015年報(bào)發(fā)布我國當(dāng)年新增癌癥病例337.2萬，癌癥死亡病例221.3萬，相當(dāng)于每分鐘就有6.4個(gè)人罹患癌癥。其中結(jié)直腸癌、男性前列腺癌、女性乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌發(fā)病率持續(xù)上升；食管癌、胃癌、肝癌發(fā)病率下降，但肺癌發(fā)病率和死亡率變化不大。肺癌發(fā)病率在我國男性患者中居第1位，在女性患者中居乳腺癌之后，死亡率均居第1位，5年生存率為16.1%，其中因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而死亡的患者比例超過90%[1]。

1循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)概述

盡管經(jīng)典理論認(rèn)為在病情進(jìn)展至晚期才會(huì)出現(xiàn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，但實(shí)際上在早期就已發(fā)生了腫瘤細(xì)胞的播散。早在1869年，Ashworth在1位因癌癥死亡患者的循環(huán)血液中發(fā)現(xiàn)一種類似于尸檢組織樣本中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞，CTCs的概念從而被首次提出[1]。目前，CTCs被定義為自發(fā)或因診療過程中由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。其中多數(shù)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后將被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，但是少量腫瘤細(xì)胞將演進(jìn)并獲得新的特征，從而在血液中存活，這些細(xì)胞即CTCs，甚至于進(jìn)一步聚集形成微小癌栓—循環(huán)腫瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)，其成分可能包括癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血小板等。相對(duì)于單個(gè)癌細(xì)胞，CTM在一定條件下更容易發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[2]。

CTCs在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中均可以被檢測到，包括在臨床確診前[3]。近年來關(guān)于各種實(shí)體瘤的研究和治療技術(shù)不斷提高，很多患者在手術(shù)等治療后雖未被檢測到殘留的腫瘤病灶，但最終卻因腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡。這可能與臨床判定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，其中最重要的即影像學(xué)技術(shù)。很多情況下并不能檢測到微小的殘留腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞存在于外周血、骨髓中，在一定條件下能夠再次增殖、浸潤，引起腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。同樣，在腫瘤患者早期未形成可被影像學(xué)檢測到的可視病灶前，外周循環(huán)血液中同樣可發(fā)現(xiàn)CTCs的存在。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中檢測CTCs不但有助于早期診斷，監(jiān)測復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，而且在治療過程中可根據(jù)CTCs的變化判定療效及預(yù)后。進(jìn)一步對(duì)CTCs進(jìn)行分子生物學(xué)分析，可以制定個(gè)體化的治療方案[4]。尤其需要注意的是，隨著基因組學(xué)研究及對(duì)腫瘤標(biāo)志物表達(dá)、缺失、差異性表達(dá)研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，由于受腫瘤異質(zhì)性的影響，臨床組織活檢雖起到確診及指導(dǎo)用藥的目的，但單次組織活檢可能會(huì)造成分子標(biāo)志物分析的偏差，在腫瘤的進(jìn)展過程中更加明顯，然而實(shí)時(shí)活檢在臨床上難以被患者接受。因此，通過對(duì)CTCs分子特征及突變的分析將會(huì)促進(jìn)更多分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及藥物的開發(fā)，對(duì)于CTCs單細(xì)胞的進(jìn)一步研究將使我們有可能對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為、疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程有更深入的認(rèn)識(shí)[3]。

2CTCs檢測方法

盡管研究人員已經(jīng)在多種類型的實(shí)體瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)CTCs，但CTCs的數(shù)量相對(duì)來說還是非常稀少的，要在數(shù)以百萬計(jì)的白細(xì)胞中檢測出CTCs，就如同大海撈針一般，并非是件容易的事情。對(duì)于CTCs的檢測，目前多數(shù)研究建立在富集的基礎(chǔ)上[5]，而對(duì)CTCs的富集主要是依據(jù)不同種類血細(xì)胞的物理特征(如大小、密度、電荷等)及生物學(xué)特征(如細(xì)胞表面蛋白等)的差異[6]。富集分離方法主要包括以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)、非標(biāo)記檢測技術(shù)、以生物物理特性為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)等。

2.1以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)免疫學(xué)富集技術(shù)是通過抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記細(xì)胞從而達(dá)到富集作用，在此技術(shù)基礎(chǔ)上與免疫磁珠、微流控設(shè)備等相結(jié)合從而開發(fā)出多種檢測系統(tǒng)。免疫磁珠技術(shù)是在細(xì)胞表面抗原與免疫磁球特異性單抗結(jié)合的基礎(chǔ)上，于外加磁場的作用下吸附復(fù)合物，達(dá)到富集的目的。這是一種使用最普遍的檢測方法。根據(jù)標(biāo)記的靶細(xì)胞是否為CTCs分為陽性富集及陰性富集兩大類。陽性富集方法即以免疫方法標(biāo)記CTCs的方法達(dá)到富集檢測的目的。市場上已有多種應(yīng)用本原理的檢測設(shè)備，如CellSearch系統(tǒng)、CTC-Chip、免疫磁性細(xì)胞分選儀(MACS)、RARE Cell、Adnatest癌細(xì)胞檢測系統(tǒng)等[7]。CellSearch系統(tǒng)是目前惟一被美國食品藥品監(jiān)督管理署(FDA)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的檢測方法，用于預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的無進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival，PFS)和總存活時(shí)間(overall survival，OS)，通過強(qiáng)力磁體將上皮黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性的CTCs從血液樣本中富集出來，證明其為上皮來源的細(xì)胞，然后通過對(duì)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、CK18、CK19、CD45和DAPI進(jìn)行免疫熒光染色，證明其為非白細(xì)胞及有核細(xì)胞，系統(tǒng)掃描分析后篩選CK陽性的細(xì)胞供檢測者判讀，符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)且CK+、DAPI+、CD45-的細(xì)胞被定義為CTCs。應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期陽性率分別為36%、45%、40%[8]。盡管CellSearch系統(tǒng)目前被認(rèn)為是精準(zhǔn)度較高的一種檢測方法，但是在炎癥性疾病等非腫瘤疾病患者外周血中可發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果的存在，更重要的是該方法的富集效率并不盡如人意。原因不難理解，盡管EpCAM被認(rèn)為是目前最優(yōu)的上皮來源腫瘤細(xì)胞的特異性抗原，但深入的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移前，原發(fā)腫瘤細(xì)胞通常會(huì)在其微環(huán)境的影響下經(jīng)歷一種被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的改變，不僅細(xì)胞形態(tài)和移動(dòng)性改變使其容易釋放及轉(zhuǎn)移，細(xì)胞基因表達(dá)譜特別是上皮抗原向間質(zhì)性表型轉(zhuǎn)變，此時(shí)的癌細(xì)胞表面EpCAM往往是不表達(dá)的，從而導(dǎo)致以EpCAM為基礎(chǔ)的CellSearch系統(tǒng)富集效率欠佳，加之該檢測費(fèi)用較高，使其在臨床上廣泛應(yīng)用受到限制。

Adnatest系統(tǒng)是通過免疫磁珠技術(shù)富集CTCs，繼以RT-PCR技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的mRNA，從而達(dá)到檢測CTCs的目的[8-12]。其可對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌患者的CTCs進(jìn)行基因表達(dá)分析。盡管此方法靈敏度較高，但它是建立在這些核酸來源于CTCs的假設(shè)的基礎(chǔ)上。另外，由于核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測到的可能只是游離的核酸而非CTCs，且部分核酸為壞死腫瘤細(xì)胞分解所釋放，易于出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且無法擺脫核酸檢測技術(shù)進(jìn)行后續(xù)分析的缺陷。

微流控技術(shù)是一種針對(duì)極小量(10-9～10-18L)流體進(jìn)行操控的系統(tǒng)科學(xué)技術(shù)，微流控芯片以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)，使得其容納流體的有效結(jié)構(gòu)(通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件)至少在1個(gè)維度上為微米級(jí)尺度。近年來，納米技術(shù)和微流控技術(shù)的結(jié)合使得CTCs捕獲效率更高。CTC-chip系統(tǒng)是以微流控設(shè)備為基礎(chǔ)，包含包被抗EpCAM抗體的微型柱，在層流的條件下捕捉CTCs[13-14]。Zhang等[15]設(shè)計(jì)了一種微流體芯片共培養(yǎng)模型，檢測效率達(dá)到68%，在富集CTCs的基礎(chǔ)上還可以進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)而進(jìn)行基因檢測、侵襲實(shí)驗(yàn)、高通量測序等后續(xù)研究。一些基于微流控芯片的CTCs分離體系也逐漸被研制出來，比如一種腫瘤細(xì)胞表面特異性識(shí)別抗體功能的魚骨形芯片(HB-chip)[16]。該芯片通過通道內(nèi)魚骨形溝回引起血液的一個(gè)輕微渦旋，增強(qiáng)抗原與抗體的接觸。相對(duì)于CellSearch檢測系統(tǒng)，該技術(shù)無需對(duì)血液樣品進(jìn)行預(yù)處理且靈敏度高。另外，將微流控與免疫磁珠相結(jié)合的檢測技術(shù)還有Ephseia[17]、isoFlux(Fluxion)[18]、LiquidBiopsy(Cynvenio)[19]等。

流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。ImageStream(Amnis)系統(tǒng)首先將熒光特異性抗體與腫瘤細(xì)胞特異性抗原結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀對(duì)熒光信號(hào)的分析從而鑒別CTCs[20]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不僅可以定量檢測CTCs，而且可以對(duì)CTCs多種參數(shù)(大小形態(tài)、細(xì)胞類型、存活狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)外標(biāo)記物)進(jìn)行分析，更容易鑒別真正的陽性細(xì)胞，但檢測靈敏度較低，在外周血中尋找相對(duì)稀少的CTCs比較耗時(shí)。

陰性富集法也是檢測CTCs的常用策略。與陽性富集不同的是，免疫磁珠標(biāo)記的抗體是能與大多數(shù)白細(xì)胞結(jié)合的抗CD45抗體，通過磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞而獲得分離出來的CTCs。類似的檢測方法還有Quadrupole magnetic separator[21]。

外周血中的單個(gè)核淋巴細(xì)胞和CTCs的密度與其他血液細(xì)胞的密度不同，在此物理特征基礎(chǔ)上建立了密度梯度離心技術(shù)，通過淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行梯度離心富集單個(gè)核淋巴細(xì)胞和CTCs，從而達(dá)到富集CTCs的目的。在此技術(shù)基礎(chǔ)上與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合建立了免疫梯度離心技術(shù)(RosetteSepTM)，利用單抗混合物使非靶細(xì)胞與全血中的多個(gè)紅細(xì)胞交聯(lián)，從而增加非靶細(xì)胞的密度，最后通過密度梯度離心去除非靶細(xì)胞，從而提高CTCs富集的效率。

2.2非標(biāo)記檢測技術(shù)膜過濾法主要基于腫瘤細(xì)胞的尺寸一般較大的特點(diǎn)(平均直徑超過8um)[22]。ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)技術(shù)，主要是利用腫瘤細(xì)胞直徑一般大于正常細(xì)胞的物理特性來分離CTCs[23]。將血液通過孔徑為8 μm的濾膜過濾，正常細(xì)胞濾過而CTCs聚集于濾膜上，從而達(dá)到富集作用。然而，外周血中單核細(xì)胞大小跨度較大，直徑可達(dá)17 μm左右[24]。因此，此方法不僅可能會(huì)漏掉直徑較小的CTCs，更可能捕獲較大的白細(xì)胞，從而使得其靈敏性及特異性下降[25]。此外，以細(xì)胞大小為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)還有CellSieve[26-27]、Parylene filter[28-29]、SceenCell[30]。微流控與過濾通道相結(jié)合的檢測裝置也獲得了應(yīng)用，通過對(duì)肺癌細(xì)胞系及肺癌臨床樣本的檢測證明這種基于CTCs大小的過濾微流體芯片相對(duì)于抗體依賴性檢測有更高的捕獲效率。目前，商業(yè)化的檢測設(shè)備有ClearCell FX、Vortex等。但由于CTCs大小和變形性等異質(zhì)性，此類非標(biāo)記捕獲技術(shù)很難有統(tǒng)一的檢測流程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

2.3基于生物物理學(xué)特性的檢測技術(shù)相對(duì)于外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，CTCs在形態(tài)學(xué)及介電性能上有著本質(zhì)的不同。介電性能與細(xì)胞的直徑，細(xì)胞膜面積、密度、導(dǎo)電率及體積等有關(guān)。ApoCell的ApoStream利用該特性在微流控通道上通過介電電泳場流分離的方法達(dá)到分離CTCs的目的，其特點(diǎn)是無需考慮EpCAM的表達(dá)，適用于后續(xù)的分析、培養(yǎng)等[31]。Silioon Biosystems的DEPArray同樣基于此生物物理學(xué)特性，可以分離單個(gè)CTC進(jìn)行進(jìn)一步的分析[32-34]。

2.4直接影像技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合檢測CTCs要求細(xì)胞流速較低，外周血中白細(xì)胞數(shù)量巨大，對(duì)于檢測相對(duì)較少的CTCs過于耗時(shí)而繁瑣。通過光纖陣列掃描技術(shù)(fiber optic array scanning technology，F(xiàn)AST)可以以快于普通電子顯微鏡500倍速度掃描，從而明顯提高檢測效率，但該方法操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用受限[35]。

2.5其他檢測方法此外，還有基于CTCs功能性實(shí)驗(yàn)達(dá)到鑒別的方法。如EPISOT技術(shù)通過抗CD45抗體陰性選擇除去白細(xì)胞后進(jìn)行短期的細(xì)胞培養(yǎng)，通過對(duì)不同的標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色鑒別分泌的蛋白，從而達(dá)到鑒定CTCs的目的，其可能對(duì)CTCs形成腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)機(jī)制的研究具有重要意義[36]。

近年來出現(xiàn)了一種稱為活體流式細(xì)胞儀的生物醫(yī)學(xué)光學(xué)儀器-PAFC技術(shù)[37]，將活體實(shí)時(shí)高速影像方法與體外流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來，通過激光檢測一段時(shí)間內(nèi)通過血管某處橫截面的帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，可以檢測整個(gè)循環(huán)血的CTCs并進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而提高靈敏度，無需對(duì)患者抽血，可盡量避免抽血時(shí)CTCs從實(shí)體瘤間斷釋放帶來的影響。

Kojima等[38]報(bào)道了一種新型的檢測有活性CTCs的方法。該研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種端粒酶特異性的選擇性復(fù)制的腺病毒(OBP-401)。該病毒載體用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的啟動(dòng)子(hTERT-p)調(diào)節(jié)腺病毒感染與復(fù)制，并在病毒的E3區(qū)插入由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白(GFP)基因。該病毒選擇性感染外周血中活的、高表達(dá)端粒酶的腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，使得綠色熒光蛋白隨著病毒的復(fù)制而高表達(dá)，讓我們通過普通的熒光顯微鏡就可以在大量的白細(xì)胞中比較容易地找到發(fā)出綠色熒光的腫瘤細(xì)胞。由于只有活細(xì)胞才能感染病毒并支持病毒復(fù)制，故通過該方法發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞應(yīng)該是能在外周血中較長時(shí)間生存的活細(xì)胞，這種活CTCs的檢出對(duì)于判斷預(yù)后、評(píng)價(jià)療效等臨床關(guān)心的問題應(yīng)該更具有參考價(jià)值。Kim等[39]通過采用這種新型方法檢測早期及晚期乳腺癌患者的CTCs，同時(shí)與CellSearch檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者在陽性率方面差別不大。

3展望

CTCs檢測方法近年來發(fā)展很快，但是仍有很多問題亟待解決。建立一系列規(guī)范的檢測流程和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，提高特異性及靈敏性，能夠進(jìn)行后續(xù)CTCs分析仍是臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，世界上大多數(shù)研究集中于CTCs的計(jì)數(shù)以及其臨床指導(dǎo)價(jià)值。但這些也許僅僅是“冰山一角”，CTCs檢測不僅可以作為一種“液體活檢”，更可以在目前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行單個(gè)CTC的分子生物學(xué)特征分析，發(fā)現(xiàn)特異的靶點(diǎn)，用于指導(dǎo)個(gè)體化靶向治療、幫助理解腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性等，這些均將成為腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的有益探索。

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(收稿日期：2015-10-26)

【中圖分類號(hào)】R 73-3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.036

通訊作者：劉紅，E-mail: liuhong925@126.com。