賈佳麗，王　輝，韓　飛，李　樂，鄭小凡（.新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南　新鄉(xiāng)　453000；.新鄉(xiāng)雅仕杰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所）

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犬孕酮幾種檢測(cè)方法比較

賈佳麗1，王輝2，韓飛1，李樂1，鄭小凡1
（1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)雅仕杰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所）

犬是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，發(fā)情周期不同于其他動(dòng)物，排卵時(shí)間在發(fā)情期間變化復(fù)雜，其最佳配種時(shí)間判定較困難。常規(guī)判定方法主要有滴血推定時(shí)間判定法、陰門觀察推定法、陰門腹側(cè)檢查法、試情法等。儀器檢測(cè)法主要有陰道鏡檢測(cè)法、陰道涂片檢測(cè)法、孕酮檢測(cè)法、唾液檢測(cè)法、測(cè)卵儀檢測(cè)法和超檢測(cè)法等。確定母犬排卵時(shí)間的范圍最可靠的方法是測(cè)定孕酮。孕酮的測(cè)定方法主要有電化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法、ELISA法、放射免疫法。本文針對(duì)犬孕酮的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

孕酮俗稱黃體酮，是由黃體和胎盤產(chǎn)生的一種甾體激素，是卵巢黃體成熟后分泌的一種天然孕激素，分子式：C21H30O2；分子量：314.47。在體內(nèi)對(duì)子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)影響顯著，在胚囊著床的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備和維持妊娠方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而且孕酮還是介于內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)交互作用的重要因子，具有調(diào)節(jié)月經(jīng)周期，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜增殖、分化，促進(jìn)血管生成，激活淋巴細(xì)胞分泌非炎性細(xì)胞因子，如IL-3、IL-4、IL-10，維持妊娠環(huán)境的作用。

1　電化學(xué)發(fā)光法（ECL）

電化學(xué)發(fā)光的測(cè)試方法主要利用電化學(xué)三電極體系，通過對(duì)工作電極施加一定的電壓，使溶液中的電活性物質(zhì)之間發(fā)生電子得失，在電極表面形成激發(fā)態(tài)并產(chǎn)生光輻射，利用光檢測(cè)器捕獲并經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理得到電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。已報(bào)道的ECL物質(zhì)包括三聯(lián)吡啶（［Ru（bpy）32+］）的釕、鋨和錸類絡(luò)合物、魯米諾、吖啶酯等。常用的抗體標(biāo)記物有吖啶酯標(biāo)記、三聯(lián)吡啶釕。

電化學(xué)發(fā)光法可以有效消除樣本的本地干擾和樣本對(duì)位量的散射，從而獲得更高的靈敏度，其檢測(cè)下限可達(dá)10-18～10-19mol/L，而且其試劑有效期長(zhǎng)，檢測(cè)快速準(zhǔn)確，安全無毒。

例如ADVIA Centaur CP孕酮測(cè)定試劑盒，在標(biāo)記試劑中，病人樣品的孕酮結(jié)合到吖啶酯標(biāo)記的小鼠單克隆抗孕酮抗體上。在固定試劑中游離的抗體與孕酮衍生物結(jié)合在一起，并通過共價(jià)鍵結(jié)合到順磁性顆粒上，通過檢測(cè)磁性顆粒對(duì)孕酮進(jìn)行定量。

2　放射免疫法（RIA）

RIA是由Yalow和Berson于1959年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術(shù)。原理是應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記待測(cè)物，形成標(biāo)記抗原。以一定量的標(biāo)記抗原，與各種不同量的非標(biāo)記待測(cè)物和一定濃度的特異性抗待測(cè)物抗體相互作用，其反應(yīng)遵照質(zhì)量作用定律，標(biāo)記待測(cè)物與非標(biāo)記待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)抗待測(cè)物抗體的結(jié)合部位，產(chǎn)生不同的結(jié)合率。當(dāng)標(biāo)記的待測(cè)物與抗待測(cè)物抗體的量保持一定時(shí)，則標(biāo)記的待測(cè)物與抗待測(cè)物抗體形成的復(fù)合物的多少就反映了待檢物的含量。按照結(jié)合率與非標(biāo)記待測(cè)物量為函數(shù)，畫出標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)測(cè)得的結(jié)合率，在曲線上找出相應(yīng)的待測(cè)物量，得出精確的待檢標(biāo)本的待測(cè)物含量。

放射免疫測(cè)定法因?yàn)椴僮鬏^復(fù)雜，需時(shí)間較長(zhǎng)，需有一定的設(shè)備，又有放射性污染，使其應(yīng)用一度受到一定限制。當(dāng)今放射免疫法已經(jīng)變得非常簡(jiǎn)單，購(gòu)買試劑盒可以短時(shí)間快速解決所有問題。使用新型的碘125標(biāo)記，輻射對(duì)人體的傷害也變得微乎其微。

放射免疫測(cè)定法是綜合應(yīng)用放射性核素的靈敏性和免疫反應(yīng)的特異性的一種超微量測(cè)定方法。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。目前已知可用本方法測(cè)定激素、多肽、蛋白質(zhì)、維生素、藥物和其他生物活性物質(zhì)300余種。

例如孕酮放射免疫分析藥盒，采用了第二抗體+聚己二醇沉淀放射法放射免疫分析實(shí)驗(yàn)，含孕酮（PROG）的樣品和125I標(biāo)記的孕酮衍生物與抗體反應(yīng)形成抗原抗體符合物，反應(yīng)加入二抗及PEG，使免疫復(fù)合物沉淀，離心，測(cè)沉淀放射性計(jì)數(shù)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本中孕酮的濃度。

3　酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann，荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）。

ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。例如兔抗孕酮試劑盒，就是孕酮與孕酮辣根過氧化酶（-HRP）酶聯(lián)試劑之間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。在溫育時(shí)，羊抗兔IgG包被的微孔與孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、患者樣品，孕酮-HRP酶聯(lián)試劑和兔抗孕酮溫育反應(yīng)，HRP標(biāo)記的孕酮結(jié)合的量與標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或定性的對(duì)照血清中內(nèi)源性孕酮對(duì)特異性孕酮抗體結(jié)合部位結(jié)合的量相競(jìng)爭(zhēng)。這樣，結(jié)合到微孔上的酮-HRP的量進(jìn)一步減少，因?yàn)闃悠分械脑型獫舛仍谠黾?，然后棄去未結(jié)合的孕酮-HRP并洗滌微孔，加入顯色劑溫育顯色，再加入HCL終止反應(yīng)并在450 nm處測(cè)量光密度值，孕酮-HRP的量與樣品中孕酮的量呈反比例關(guān)系并與所形成的顏色的深淺成一定比例，通過標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)吸收值標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。孕酮ELISA試劑盒樣品與標(biāo)準(zhǔn)品一同操作的對(duì)照品孕酮的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來。

4　小結(jié)

孕酮在發(fā)情前期即將結(jié)束時(shí)開始升高，一般達(dá)到5 ng/mg時(shí)即可排卵。一般在母犬發(fā)情之后，進(jìn)行陰道黏膜檢查，當(dāng)陰道角質(zhì)化到達(dá)50%，孕酮達(dá)到4～5 ng/ml時(shí)，發(fā)情母犬進(jìn)入最佳配種期，一般在孕酮達(dá)到4～5 ng/ml后的1～3 d內(nèi)完成配種。對(duì)孕酮進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能更好地把握配種時(shí)間。

孕酮的檢測(cè)方法除了上述的3種外，還有報(bào)道用免疫熒光法測(cè)定孕酮含量，但臨床測(cè)定中已經(jīng)很少使用。電化學(xué)發(fā)光法、ELISA法、放射免疫法三種方法比較，試劑方面，放射免疫法和酶聯(lián)免疫法都已經(jīng)國(guó)內(nèi)量產(chǎn)，化學(xué)發(fā)光法試劑及全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀儀器以進(jìn)口產(chǎn)品占主導(dǎo)。在測(cè)量精度上，酶標(biāo)法是定性與半定量測(cè)量，化學(xué)發(fā)光法為定量測(cè)量。線性試驗(yàn)和靈敏度檢測(cè)中，電化學(xué)發(fā)光法優(yōu)于放射免疫法。對(duì)人體的的傷害，放射免疫法有一定的放射性，酶標(biāo)法的底物有一定的致癌性，化學(xué)發(fā)光法比較安全。干擾因素方面，放射免疫法和酶標(biāo)法干擾因素較多。電化學(xué)發(fā)光法有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在犬的孕酮檢測(cè)中可以靈活使用。一般可使用簡(jiǎn)單儀器結(jié)合常規(guī)判定方法進(jìn)行判斷，昂貴犬種可使用更加精密的儀器進(jìn)行測(cè)定。

收稿日期：（2016-02-26）

中圖分類號(hào)：S829.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

文章編號(hào)：1004-5090（2016）04-0042-02