細胞內(nèi)吞和自噬對MMPs調(diào)節(jié)的研究進展

張曉毅，余文敏，劉蕾，陳平圣

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南京　210009)

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細胞內(nèi)吞和自噬對MMPs調(diào)節(jié)的研究進展

張曉毅，余文敏，劉蕾，陳平圣

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南京210009)

[摘要]真核細胞以一種復(fù)雜而高效的膜轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)維持細胞內(nèi)外物質(zhì)循環(huán)和新舊更替。Rab蛋白做為全局性調(diào)節(jié)因子，參與從膜發(fā)生、成熟到膜融合的幾乎所有步驟，將各種膜轉(zhuǎn)運形式如內(nèi)吞和自噬等聯(lián)系在一起。內(nèi)吞能夠調(diào)節(jié)細胞表面分子的分布和功能狀態(tài)，而進入胞漿的蛋白可經(jīng)由內(nèi)吞體循環(huán)，或者在自噬小體作用下被降解利用，輔助細胞度過饑餓、缺氧等危機?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在細胞表面的分布和活性受到內(nèi)吞調(diào)節(jié)，并且MMPs在細胞內(nèi)循環(huán)和運輸與Rab蛋白關(guān)系密切。在本文作者簡要回顧細胞內(nèi)吞和自噬的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，闡述膜結(jié)構(gòu)變動對MMPs分布和功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)吞; 自噬; Rab蛋白; 基質(zhì)金屬蛋白酶; 膜結(jié)合型基質(zhì)金屬蛋白酶

在腫瘤研究領(lǐng)域，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)、促進腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移是公認的指導(dǎo)原則，但過去15年，有超過50種廣譜MMPs抑制劑(TIMPs)用于腫瘤臨床試驗，卻未能取得預(yù)期效果[1]。除臨床試驗設(shè)計本身外，MMPs/TIMPs調(diào)節(jié)系統(tǒng)的復(fù)雜性是重要原因之一。MMPs和TIMPs動態(tài)平衡并不單純控制細胞外基質(zhì)構(gòu)建，也并非所有MMPs都促進腫瘤侵襲。MMPs能夠?qū)Πɑ|(zhì)蛋白在內(nèi)的多種蛋白進行處理，調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡和炎癥等[2]，而TIMPs在特定條件下與MMPs結(jié)合，限制MMPs作用的發(fā)揮，反過來MMPs也可能影響TIMPs非蛋白分解依賴的作用[3]。

纖維化是肺、肝、腎等多種臟器發(fā)生慢性損傷后的共同病理通路，也是引起器官功能衰竭的重要原因[4- 5]。纖維化過程具有可逆性，直接或者間接調(diào)節(jié)MMPs和基質(zhì)重構(gòu)是治療纖維化性疾病頗具潛力的靶點。但是，直接干預(yù)MMPs或其抑制劑治療纖維化疾病的動物實驗常常效果不佳，甚至和預(yù)期結(jié)果相悖[6- 7]。近年來，伴隨著許多具有潛力的抗纖維化藥物如LOXL2單克隆抗體、BMP- 7衍生物等已經(jīng)或者正在進入臨床試驗[8]，我們在寄予希望的同時，對MMPs和細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)進行更多具有創(chuàng)新性的研究將有助于面對未知的問題和挑戰(zhàn)。真核細胞具有多種動態(tài)的膜型結(jié)構(gòu)，有的長期存在，有的臨時形成，并且以一種復(fù)雜而高效的膜轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)將細胞各個成分有機聯(lián)系在一起，例如典型的哺乳動物細胞，每小時有相當(dāng)于50%~180%面積的細胞膜循環(huán)進出細胞[9]。Rab蛋白是一種小GTP酶，屬于Ras樣GTP酶超家族，參與從膜發(fā)生、成熟到膜融合的幾乎所有步驟，在內(nèi)吞體和自噬小體形成和成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。并且，MMPs，尤其是膜結(jié)合型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT- MMPs)的胞外分布和胞內(nèi)循環(huán)也離不開Rab蛋白的調(diào)節(jié)[11]。

1內(nèi)吞和膜結(jié)構(gòu)變化

1.1內(nèi)吞系統(tǒng)

內(nèi)吞途經(jīng)包含循環(huán)回路、分解系統(tǒng)和銜接途經(jīng)3種要素[9]。細胞膜、早期內(nèi)吞體和循環(huán)內(nèi)吞體組成循環(huán)回路，分解系統(tǒng)主要含溶酶體，而銜接途徑負責(zé)將運輸物和膜成分從循環(huán)回路輸送到分解系統(tǒng)。循環(huán)回路發(fā)揮作用不依賴分解系統(tǒng)，而分解系統(tǒng)是細胞內(nèi)物質(zhì)分解的共用結(jié)構(gòu)，不僅接收來自晚期內(nèi)吞體的運輸物，也分解來自成熟自噬小體的內(nèi)容物。晚期內(nèi)吞體既能夠調(diào)節(jié)銜接途徑，也調(diào)節(jié)反式高爾基體網(wǎng)(trans- Golgi network，TGN)向溶酶體輸送膜成分和水解酶，維持循環(huán)回路和分解系統(tǒng)的穩(wěn)定。目前認為，內(nèi)吞循環(huán)回路不僅能夠調(diào)節(jié)膜表面分子和離子通道等的分布，也能夠影響細胞間連接分子，維持極性細胞頂端和基底端的極性，并且調(diào)節(jié)細胞的特化結(jié)構(gòu)如原纖毛和頂端微絨毛的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)[12]。

最近研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)吞體在自噬小體形成早期的某些階段發(fā)揮重要作用。細胞膜上的兩種ATG蛋白，即ATG9和ATG16L1，在參與自噬小體形成時分別經(jīng)由不同的網(wǎng)格蛋白被膜小窩內(nèi)化進入細胞，前者經(jīng)由早期內(nèi)吞體、循環(huán)內(nèi)吞體到達自噬泡，后者越過早期內(nèi)吞體，直接由細胞膜轉(zhuǎn)運至循環(huán)內(nèi)吞體，再到達自噬泡。這兩種蛋白在到達循環(huán)內(nèi)吞體時彼此獨立，而在循環(huán)內(nèi)吞體中含有兩種蛋白的囊泡相互融合。SNARE VAMP3在ATG9- ATG16L1囊泡融合以及自噬小體生物合成中具有重要作用，并且ATG16L1- ATG9囊泡融合可能發(fā)生在自噬泡階段以前[13]。

1.2Rab蛋白

Rab蛋白參與膜轉(zhuǎn)運時受到多種上游因子調(diào)控，在胞質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)之間循環(huán)利用。在Rab蛋白翻譯完成后，由Rab護衛(wèi)蛋白(REP)將其呈遞給香葉酰香葉酰轉(zhuǎn)換酶(RabGGT)，后者添加1~2個香葉酰香葉酰脂質(zhì)到Rab的羧基端，形成含有異戊二烯基尾部結(jié)構(gòu)。Rab蛋白如何靶向定位到特定膜結(jié)構(gòu)并不完全清楚，可能需要GDI移位因子(GDFs)參與。鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)催化GDP結(jié)合型Rab轉(zhuǎn)化為GTP結(jié)合型Rab使其活化?；罨腞ab蛋白與其效應(yīng)因子相互作用特異性促進其各自途經(jīng)的轉(zhuǎn)運。GTP酶催化蛋白(GAP)與活化型Rab相互作用，使GTP水解為GDP，Rab回到失活狀態(tài)。最后鳥嘌呤核苷酸分離抑制因子GDI使GDP結(jié)合型Rab從膜上分離，為新一輪循環(huán)做準備[14]。

Rab5貫穿早期內(nèi)吞體從形成到成熟的各個階段，并在早期內(nèi)吞體向晚期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化中做為主要調(diào)節(jié)者。在早期內(nèi)吞體演變階段，胞漿中GDP結(jié)合型Rab5在Rabex- 5作用下活化為GTP結(jié)合型Rab5，并嵌入早期內(nèi)吞體膜上發(fā)揮效應(yīng)。內(nèi)吞體成熟時，胞漿中Mon1/SAND- 1復(fù)合體聯(lián)合Ccz1與Rab5、PtdIns(3)P和Rabex- 5結(jié)合，使Rabex- 5從膜上分離，終止Rab5活化。并且Mon1/SAND- 1- Ccz1復(fù)合體直接或者間接促進Rab7的募集與活化。其中，內(nèi)吞體膜上PtdIns(3)P的濃度可能是Rab轉(zhuǎn)換時間段的決定因素。

隨著Rab5向Rab7轉(zhuǎn)換，內(nèi)吞體的特性也發(fā)生變化。內(nèi)吞體變?yōu)闄E圓形，腔內(nèi)PH下降，PtdIns(3)P轉(zhuǎn)變?yōu)镻tdIns(3，5)P(2)。當(dāng)內(nèi)吞體獲得與溶酶體融合的能力時也失去了接收內(nèi)容物的能力，無法再進行同型融合。

2自噬和膜結(jié)構(gòu)變化

2.1自噬概述

哺乳動物細胞通常發(fā)生基礎(chǔ)水平的自噬，能夠以最合理的方式分解胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器用于細胞生存和其它功能。自噬通路可在多種細胞危機下增強，例如營養(yǎng)耗竭、缺氧、細胞器受損或者病原體侵襲。不同形式的細胞危機能夠特異性影響自噬，調(diào)整自噬的不同階段。例如缺氧誘導(dǎo)的自噬，中度缺氧(0.1%~3%)通過HIF- 1途徑誘導(dǎo)自噬，其中有HIF- 1靶基因BNIP3參與；嚴重缺氧(<0.1%)不依賴HIF- 1，而通過AMPK- mTOR途徑和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)途徑誘導(dǎo)自噬[15]。自噬并非缺氧狀態(tài)下活化的唯一通路，相反，缺氧狀態(tài)下細胞的多條應(yīng)答途徑同時或者先后活化，它們之間可能以整合的關(guān)系存在。

2.2自噬小體發(fā)生

在酵母和哺乳動物細胞中自噬泡組裝位點(PAS)，自噬相關(guān)蛋白(Atgs)等成分在磷脂酰肌醇- 3- 激酶(PI3K)參與下組裝形成自噬小體的膜結(jié)構(gòu)。例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上富含磷脂酰肌醇- 3- 磷酸(PtdIns- 3- P)的歐米伽小體，Atgs在此組裝形成自噬小體的界膜。另外，在饑餓刺激下線粒體的外膜也為自噬小體形成提供脂質(zhì)等。除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外，細胞膜成分也參與自噬小體形成，并且和網(wǎng)格蛋白調(diào)節(jié)的內(nèi)吞關(guān)系密切。抑制網(wǎng)格蛋白調(diào)節(jié)的內(nèi)吞或者破壞Atg16L與網(wǎng)格蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)吞的相互作用能夠部分抑制PSA形成，提示細胞膜不僅為自噬小體提供構(gòu)建材料，也可能經(jīng)由內(nèi)吞途徑調(diào)節(jié)自噬過程。目前不清楚在何種刺激下細胞膜會成為自噬小體的主要參與者。

2.3自噬小體形成

自噬啟動時Atg1/ULK復(fù)合體移動到PAS，聯(lián)合Beclin1/PI3K復(fù)合體啟動吞噬泡形成和延伸。前者位于mTORC1下游，營養(yǎng)正常時mTORC1使Atg13和ULK處于磷酸化狀態(tài)。營養(yǎng)耗竭時mTORC1受到抑制，與ULK復(fù)合體分離，引起Atg13和ULK內(nèi)特定殘基去磷酸化，ULK活化并使Atg13其它殘基和FIP200磷酸化，進而誘導(dǎo)自噬小體形成。Beclin1/PI3K復(fù)合體包含Beclin 1、Vps15、Vps34等，Vps34活化產(chǎn)生PtdIns- 3P，后者參與調(diào)節(jié)自噬小體形成的起始階段。多種蛋白能夠與Beclin1相互作用誘導(dǎo)或者抑制自噬，例如抗凋亡家族成員(Bcl- 2、Bcl- XL和Mcl- 1)通過它們的Bp結(jié)合凹槽與Beclin1的Bp域結(jié)合產(chǎn)生抑制性相互作用，是自噬重要的負性調(diào)節(jié)劑。

吞噬泡形成過程中可能需要來自其它細胞器膜結(jié)構(gòu)的輸入，需要Atg9和VMP1兩種跨膜蛋白參與。Atg9是一種在反式高爾基體和內(nèi)吞體之間循環(huán)的跨膜蛋白，可能為吞噬泡的延伸輸送膜結(jié)構(gòu)，其中有Atg1/ULK1復(fù)合體和Vps34激酶參與。囊泡膜蛋白1(VMP1)做為跨膜蛋白能夠與Beclin1相互作用，能夠募集Beclin1和Beclin1復(fù)合體其它成分到達吞噬泡。

自噬囊泡延伸過程需要兩種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)參與，即Atg12和Atg8/LC3。Atg12系統(tǒng)是在E1樣酶Ath7和E2樣酶Atg10輔助下Atg12共價結(jié)合到Atg5，Atg12- Atg5與Atg16非共價結(jié)合形成Atg12- Atg5- Atg16多聚復(fù)合體，后者可做為LC3的E3連接酶。Atg8/LC3系統(tǒng)是磷脂酰乙醇胺(PE)與酵母Atg8或者哺乳動物L(fēng)C3的甘氨酸殘基經(jīng)由蛋白酶Atg4、E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg3等一系列后續(xù)反應(yīng)而結(jié)合。引起可溶型的LC3(LC3- Ⅰ)向自噬囊泡相關(guān)型的LC3(LC3Ⅱ)轉(zhuǎn)化。LC3的脂質(zhì)形式與自噬小體膜穩(wěn)定相關(guān)，廣泛用于衡量細胞自噬[16]。

2.4內(nèi)吞和自噬交互作用

自噬途徑和內(nèi)吞途徑之間的交互作用可能對兩者均具有重要的調(diào)節(jié)作用[17]。自噬小體能夠與內(nèi)吞體融合形成兩性體，該過程可能促進自噬小體的成熟。其中Rab11參與循環(huán)內(nèi)吞體的囊泡向自噬泡的運輸過程，促進自噬小體形成[18]。Hook作為內(nèi)吞體成熟的負性調(diào)節(jié)劑，在營養(yǎng)充足條件下能夠?qū)⑼砥趦?nèi)吞體錨定在微管上，抑制內(nèi)吞體成熟。饑餓啟動自噬時，Rab11將Hook從晚期內(nèi)吞體上移除，并且抑制Hook的同源二聚化，促進內(nèi)吞體和自噬小體融合，增強自噬流[19]。

3膜結(jié)構(gòu)變化和MMPS調(diào)節(jié)

3.1膜表面MT1- MMP功能

膜結(jié)合型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT- MMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶的亞群，在人類共有6種，可進一步分為Ⅰ型跨膜型(MT1、MT2、MT3、MT5- MMPs)和糖基磷脂酰肌醇GPI- 錨定型(MT4、MT6- MMPs)。這兩種類型均結(jié)合在細胞膜上，特定的分布使其與細胞周圍微環(huán)境的調(diào)節(jié)以及細胞遷移關(guān)系密切。

膜結(jié)合型MT1- MMP通過血紅素結(jié)合蛋白域和跨膜區(qū)與另一個MT1- MMP形成同源二聚體，TIMP- 2的氨基酸與其中一個MT1- MMP的催化域結(jié)合抑制其活性。而MMP- 2前體的血紅素結(jié)合域和TIMP- 2羧基端非抑制區(qū)相互作用而結(jié)合，在膜上形成MT1- MMP、TIMP- 2、MMP- 2前體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。MT1- MMP異源二聚體中另一個不與TIMP- 2結(jié)合的MT1- MMP在MMP- 2前體的前肽區(qū)中部的Asn37- Leu位點使其裂解，觸發(fā)MMP- 2中間體的自身催化活性。MT1- MMP的MT環(huán)結(jié)構(gòu)能夠參與這一激活過程，能夠調(diào)節(jié)MMP- 2前體和MT1- MMP相互作用[20]。TIMP- 2的羧基端結(jié)構(gòu)可能在活化MMP- 2中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。激活的MMP- 2被釋放或者仍然與TIMP- 2結(jié)合，膜上可能有另外一種以不同形式結(jié)合的TIMP- 2，這種TIMP- 2能夠抑制MMP- 2活性[22]。

3.2內(nèi)吞調(diào)節(jié)MMPs

MT1- MMP經(jīng)過網(wǎng)格蛋白依賴和小窩蛋白依賴兩種方式被細胞內(nèi)吞，在細胞表面半衰期小于30min[23]。MT1- MMP胞內(nèi)區(qū)LLY573與網(wǎng)格蛋白的組分適配蛋白μ2亞單位相互作用參與網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑[24]。在內(nèi)皮細胞，小窩蛋白- 1和MT1- MMP相互作用可能誘導(dǎo)了內(nèi)皮細胞小窩依賴的MT1- MMP內(nèi)吞[25]。經(jīng)由內(nèi)吞的MT1- MMP也能夠沿內(nèi)吞循環(huán)回到細胞表面[26]。MT1- MMP胞內(nèi)區(qū)羧基端DKV582序列是循環(huán)所必需的[27]。目前不清楚MT1- MMP循環(huán)究竟有多大影響，在表達水平上，MT1- MMP胞內(nèi)區(qū)DKV582突變型與MT1- MMP野生型酶在MMP- 2前體活化和細胞的促遷移效應(yīng)上一致[24]。

低密度脂蛋白相關(guān)蛋白受體1(LRP1)可經(jīng)由α2M蛋白酶復(fù)合體介導(dǎo)多種細胞外MMPs及其內(nèi)源性抑制劑的內(nèi)吞，是調(diào)節(jié)組織中蛋白酶活性的重要途徑[28]。LRP1介導(dǎo)的內(nèi)吞效率與LRP1對MMPs的親和力以及LRP1的剪切狀態(tài)有關(guān)。MT1- MMP、ADAM10和ADAM17等能夠?qū)RP1進行剪切，剪切后的LRP1仍具有與配體結(jié)合的能力，可能作為陷阱受體發(fā)揮作用[29]。LRP1經(jīng)由α2M也能夠調(diào)節(jié)MT1- MMP的分布和活性[30]。

3.3Rab蛋白與MMPs調(diào)節(jié)

內(nèi)吞引起細胞膜表面分子的內(nèi)化和循環(huán)是調(diào)節(jié)MT1- MMP在細胞表面分布和濃度的重要方式，并且Rab蛋白在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如巨噬細胞MT1- MMP在Rab5a、Rab8a和Rab14等調(diào)節(jié)下分泌到偽足小體，促進基質(zhì)分解和巨噬細胞遷移[31]。乳腺癌細胞β1整合素與膠原基質(zhì)連接可觸發(fā)含有MT1- MMP的囊泡以Rab8依賴的方式運輸?shù)侥z原基質(zhì)[32]。也有研究顯示巨噬細胞中含MT1- MMP的囊泡運輸?shù)絺巫阈◇w是由KIF5B和KIF3A/KIF3B驅(qū)動蛋白分子調(diào)節(jié)[33]。在上皮細胞MT1- MMP的分布與細胞極性有關(guān)，在肝細胞生長因子(HGF)刺激下細胞分泌的MT1- MMP可部分由管腔側(cè)移動到基底膜側(cè)[34]。

另外，膜上其它分子的分布和濃度也影響MT1- MMP的狀態(tài)，例如TIMP- 2在低濃度時促進MT1- MMP依賴的MMP- 2前體的活化，而TIMP- 2高濃度時這種活化作用受到抑制；膜上GPI錨定結(jié)合的RECK分子對MT1- MMP功能發(fā)揮具有重要影響。RECK在HT1080細胞表達時，MMP- 2總量不變，但MMP- 2的活性明顯下降，這可能是RECK直接抑制MT1- MMP，進而抑制MT1- MMP對MMP- 2前體第一階段的活化，也可能是RECK抑制MMP- 2的自身分解的第二階段活化或者直接抑制MMP- 2的催化活性[35- 36]。

SNARE蛋白是真核細胞內(nèi)吞及分泌的關(guān)鍵因子，介導(dǎo)囊泡與目標膜結(jié)構(gòu)的融合。SNARE蛋白也參與調(diào)節(jié)多種細胞中MT1- MMP運輸。PMA刺激HT- 1080細胞引起MT1- MMP內(nèi)化之后，MT1- MMP首先運輸?shù)胶蠷ab5的早期內(nèi)吞體，接著大部分過渡到含有Rab7和VAMP7的晚期內(nèi)吞體，再次接受PMA刺激后MT1- MMP能夠重新回到細胞膜。這提示運輸?shù)酵砥趦?nèi)吞體并不意味著MT1- MMP表達的下調(diào)，而是作為循環(huán)途徑在特定條件下使MT1- MMP重返細胞膜，并且Rab7可能在MT1- MMP向細胞膜循環(huán)中發(fā)揮作用[37]。

4展望

腫瘤和器官纖維化是威脅人類健康的兩大類疾病，調(diào)節(jié)MMPs是阻止腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)纖維化頗具潛力的靶點。但是，應(yīng)用廣譜MMPs抑制劑治療腫瘤的臨床試驗沒有取得預(yù)期效果，器官纖維化的治療仍然停留在起步階段。細胞的內(nèi)吞和自噬現(xiàn)象緊密交織，是生命活動的普遍規(guī)律，它們在維持胞內(nèi)物質(zhì)新舊更替的同時，也對細胞表面分子和周圍微環(huán)境具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，伴隨著許多具有潛力的抗纖維化藥物進入臨床試驗階段，我們在寄予希望的同時，對MMPs和細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)進行更多具有創(chuàng)新性的研究將有助于面對未知的問題和挑戰(zhàn)。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．029

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0125- 05

[通信作者]陳平圣E- mail:chenpsh@sina.com

[作者簡介]張曉毅(1990-)，男，山西運城人，在讀碩士研究生。E- mail:zhxynanjing@outlook.com

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(81370868)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目和江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃資助項目(KYLX_0197)

[收稿日期]2015- 07- 12[修回日期] 2015- 09- 08

[引文格式] 張曉毅，余文敏，劉蕾，等.細胞內(nèi)吞和自噬對MMPs調(diào)節(jié)的研究進展[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：125- 129.

·綜述·