10種藥物材料對銅綠微囊藻的抑制作用*

胡利靜 肖艷翼 劉騰飛 吳映捷 胡 鯤 楊先樂

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，國家水生動物病原庫，上海 201306)

藍藻(Cyanophyta)是單細(xì)胞原核生物，又叫藍細(xì)菌、藍綠菌或藍綠藻，是一類藻類的總稱，主要指色球藻目(Chroococcales)、顫藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、真枝藻目(Stigonema)4個目，可在營養(yǎng)豐富的淡水水體中出現(xiàn)。藍藻中有些種類常于夏季高溫時大量繁殖，并在水面形成一層藍綠色且有腥臭味的浮沫，稱為“水華”。藍藻水華的種類有很多，主要有微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、鞘顫藻(Lyngbya)、束絲藻(Aphanizomenon)、顫藻(Oscillatoria)[1]，其中以產(chǎn)毒的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)最為常見。銅綠微囊藻大量繁殖時，水面會被厚厚的藍綠色湖靛所覆蓋，改變了水體的理化環(huán)境，降低了水體的透明度[2]，影響魚蝦等水生動物的正常生長；水體中營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡時，銅綠微囊藻開始大量死亡，藻細(xì)胞破解，使水體散發(fā)腥臭味，溶解氧減少，造成魚蝦等水生動物的死亡，所以池塘養(yǎng)殖水體中過量的銅綠微囊藻威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，因此研發(fā)綠色環(huán)保的抑藻藥物勢在必行。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中藍藻的除殺多采用人工或機械打撈、化學(xué)藥物殺藻等方法。人工或機械打撈的方法雖見效快，但勞動強度大、操作困難、耗時、效率低而且費用高，因此實際生產(chǎn)中以化學(xué)藥物抑藻方法為主。水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的化學(xué)抑藻藥物為硫酸銅，但硫酸銅的大量使用和使用次數(shù)的增加常會使重金屬在養(yǎng)殖水域中積累，引發(fā)二次污染，并影響水生生物生長等。因此，尋求經(jīng)濟、安全、環(huán)保、有效的抑藻藥物，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。本研究從藥食兩用的植物及常見的中草藥中選擇了10種藥物材料，對銅綠微囊藻進行抑制效果篩選試驗，并對初篩藥物的有效劑量進行測定，以期為開發(fā)綠色環(huán)保的抑藻藥物提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 供試藻種

銅綠微囊藻藻種購買于中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，編號為FACHB-434。

1.1.2 抑藻材料

蜜桔、馬水桔、蜜柚、大蒜從市場上購得；鐵觀音、大麥茶購于商店；仙鶴草、大黃、土槿皮提取物、黃連提取物等購于藥店。

1.1.3 主要儀器

MGC-250BPY-2智能型光照培養(yǎng)箱；DU730分光光度計(美國Beckman)；Allegra X-15R低速冷凍離心機(美國Beckman)。

1.2 培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件

銅綠微囊藻的培養(yǎng)按淡水藻種庫提供配方，采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度(25.0±0.5) ℃，光照強度3 000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天搖動3～5次。

1.3 浸提液制備方法

蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮水提液的制備參考文獻[3]的提取方法，自來水沖洗柑橘皮表面灰塵，將柑橘皮切成小塊，在烘箱中干燥。以桔皮(干質(zhì)量，下同)/去離子水為0.05 kg/L的比例，用去離子水在4 ℃黑暗中浸提4 d。

大蒜液制備：稱取100 g去皮大蒜，加入100 mL去離子水，攪拌成糜狀后擠壓得汁液，置于磨口試劑瓶中，室溫保存，大蒜質(zhì)量濃度為1 kg/L。

鐵觀音、大麥茶浸提液制備：稱取鐵觀音、大麥茶2 g，加去離子水20 mL，煮沸10 min，重復(fù)一次，合并兩次茶液并用去離子水定容至20 mL，使茶液的最終質(zhì)量濃度為100 g/L作為試驗原液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

仙鶴草、大黃浸提液制備參考文獻[4]的提取方法，按藥物/蒸餾水為0.10 kg/L的比例分別將兩種藥物加入盛一定量蒸餾水的燒杯中，置于電爐上煮沸浸提，煮沸20 min后濾出藥液，定容，使藥液質(zhì)量濃度為100 g/L作為試驗原液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

土槿皮提取物、黃連提取物浸提液制備:按藥物/蒸餾水為0.05 kg/L的比例分別將兩種藥物加入盛一定量蒸餾水的燒杯中，煮沸10 min后過濾，定容，使藥液質(zhì)量濃度為50 g/L作為試驗原液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗方法

1.4.1 篩選試驗

將銅綠微囊藻在BG11培養(yǎng)基下預(yù)培養(yǎng)10～15 d，使其處于對數(shù)生長期，作為接種的藻種。在無菌條件下，在250 mL的錐形瓶中各加入20 mL藻液，初始葉綠素a為0.340 6 μg/mL，并分別加入一定量的浸提液，最后加入無菌培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液總體積為100 mL。最終使蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮水提液質(zhì)量濃度均為6.25 g/L，大蒜液和鐵觀音、大麥茶、仙鶴草、大黃浸提液的質(zhì)量濃度均為5.000 g/L，土槿皮提取物、黃連提取物浸提液的質(zhì)量濃度均為2.500 g/L。每組3個平行，并設(shè)空白對照組。

1.4.2 有效藥物最佳抑藻濃度確定

根據(jù)篩選結(jié)果，采用二倍稀釋法將有效藥物的母液依次倍數(shù)稀釋，查看抑藻效果，確定藥物的最佳抑藻濃度。每組3個平行，并設(shè)空白對照組。

1.4.3 測定指標(biāo)

由于活體藻類中葉綠素a的含量較高，而在死亡藻體、浮游動物及其他無機漂浮物中葉綠素a的含量較低，因此把葉綠素a含量的測定作為測量藻類生物量的重要指標(biāo)[5]。

葉綠素a測定：參考文獻[6]的測定方法，即取3 mL培養(yǎng)液，3 500 r/min下離心10 min，棄去上清液，然后加入等體積90%的(體積分?jǐn)?shù))甲醇，混合均勻。將混勻的溶液放置在4 ℃黑暗條件下萃取6～8 h，然后3 500 r/min下再離心10 min，取上清液，用分光光度計測定其在665 nm處的吸光度(OD665)，并計算葉綠素a的含量，計算公式[7]為：

c=13.9×OD665

(1)

式中：c為葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/mL。

表1 10種材料對銅綠微囊藻生長的抑制率1)

注：1)相同字母的數(shù)據(jù)間沒有顯著差異,不同字母的數(shù)據(jù)間差異顯著。

1.5 數(shù)據(jù)分析

各浸提液對銅綠微囊藻生長的抑制率計算公式為：

IR=(1-N/N0)×100%

(2)

式中：IR為抑制率，%；N為浸提液組藻的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/mL；N0為對照組藻的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/mL。

所得數(shù)據(jù)用Excel 2003和IBM SPSS Statistics 19.0軟件程序包進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10種材料對銅綠微囊藻生長抑制率的影響

10種材料對銅綠微囊藻生長抑制率的影響如表1所示。經(jīng)統(tǒng)計分析可知，從1 d時的抑制率來看，蜜桔皮、蜜柚皮、馬水桔皮對銅綠微囊藻生長的抑制率較大；大黃、土槿皮提取物、黃連提取物對銅綠微囊藻的抑制率次之，且3者之間無顯著差異；大蒜、大麥茶對銅綠微囊藻的抑制率最低。從2 d的抑制率來看，3種柑橘皮對銅綠微囊藻的抑制率依然較高，且明顯高于其他7種材料對銅綠微囊藻的抑制率；大黃、土槿皮提取物、黃連提取物對銅綠微囊藻的抑制率次之；仙鶴草、大蒜、大麥茶對銅綠微囊藻的抑制率較低。從3～5 d的抑制情況看，大蒜對銅綠微囊藻的抑制率上升較快；仙鶴草、大麥茶對其的抑制率仍保持較低水平；其他材料抑藻率較大，且不同的材料間有不同的差異性。

2.2 10種材料對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

10種材料在不同時間內(nèi)對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響如圖1所示。銅綠微囊藻各處理組作用的時間對葉綠素a含量的回歸方程如表2所示，其中y為銅綠微囊藻的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/mL；x為各處理組作用的時間，d。從圖1及表2可以看出，蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、土槿皮提取物、黃連提取物浸提液組中銅綠微囊藻的葉綠素a含量隨著時間延長呈下降趨勢，各組間下降的幅度略有不同，馬水桔皮>蜜桔皮>蜜柚皮>黃連提取物>土槿皮提取物。大蒜、鐵觀音、大麥茶、仙鶴草、大黃的浸提液組及對照組中銅綠微囊藻的葉綠素a含量隨著時間延長呈上升趨勢，大蒜、鐵觀音、大黃的浸提液組上升幅度明顯小于仙鶴草和大麥茶，且這些浸提液組中葉綠素a含量的上升幅度均低于對照組的上升幅度，但仙鶴草和大麥茶浸提液組葉綠素a含量的上升幅度與對照組相差不大。

表2 銅綠微囊藻各處理組作用的時間對葉綠素a含量的回歸方程

2.3 有效材料抑藻最佳濃度的確定

各質(zhì)量濃度蜜桔皮水提液對銅綠微囊藻葉綠素a的作用效果如圖2所示，其中0.39、0.78 g/L濃度組與對照組中銅綠微囊藻葉綠素a變化相似；1.56 g/L濃度組的銅綠微囊藻葉綠素a的合成呈上升趨勢，但與對照組相比上升幅度降低，說明該濃度組對銅綠微囊藻葉綠素a的合成具有一定的抑制能力；3.13 g/L濃度組使銅綠微囊藻的葉綠素a基本維持在初始值(0.340 6 μg/mL)狀態(tài)；而6.25、12.50、25.00 g/L濃度組能明顯抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成。

圖1 10種材料對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of 10 kinds material on growth of M. aeruginosa

圖2 蜜桔皮對銅綠微囊藻生長的影響Fig.2 Effect of Tangerine peel on growth of M. aeruginosa

如圖3所示，馬水桔皮水提液質(zhì)量濃度為1.56 g/L時銅綠微囊藻的葉綠素a能基本維持在初始值狀態(tài)，當(dāng)小于1.56 g/L時對銅綠微囊藻葉綠素a的合成抑制率減弱甚至促進其合成，當(dāng)大于1.56 g/L時能抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成。

如圖4所示，蜜柚皮水提液0.78、1.56 g/L濃度組的葉綠素a與初始值相比略有增長，而3.13 g/L濃度組與初始值相比略有下降，0.39 g/L濃度組的葉綠素a反而超過了對照組的葉綠素a含量，而大于3.13 g/L的各濃度組均對銅綠微囊藻的葉綠素a合成具有抑制作用。

圖3 馬水桔皮對銅綠微囊藻生長影響Fig.3 Effect of Mashui orange peel on growth of M. aeruginosa

圖4 蜜柚皮對銅綠微囊藻生長的影響Fig.4 Effect of Pomelo peel on growth of M. aeruginosa

大蒜液對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響如圖5所示。0.313 g/L濃度組對其葉綠素a的合成無抑制作用，其他各濃度組隨著時間的延長葉綠素a含量總體呈增長趨勢，但在同一個時間點其葉綠素a均低于對照組，且隨著大蒜液濃度的增大葉綠素a含量的增長幅度降低。當(dāng)其大于5.000 g/L時，葉綠素a含量基本維持在初始水平。

圖5 大蒜對銅綠微囊藻生長的影響Fig.5 Effect of Allium sativum on growth of M. aeruginosa

圖6、圖7分別為鐵觀音、大黃浸提液對銅綠微囊藻生長影響趨勢圖。在2.500 g/L時兩種材料均使銅綠微囊藻的葉綠素a維持在初始值附近；當(dāng)大于2.500 g/L時兩種材料均能有效抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成，且大黃的抑制效果好于鐵觀音；當(dāng)小于2.500 g/L時，除大黃1.250 g/L濃度組外其他濃度組中的葉綠素a含量與對照組的接近且均呈增長趨勢；大黃1.250 g/L濃度組葉綠素a含量雖有增長趨勢，但明顯低于對照組。

圖6 鐵觀音對銅綠微囊藻生長的影響Fig.6 Effect of Tieguanyin tea on growth of M. aeruginosa

圖7 大黃對銅綠微囊藻生長的影響 Fig.7 Effect of Radix et Rhizoma Rhei on growth of M. aeruginosa

如圖8、圖9所示，土槿皮、黃連提取物浸提液對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響相似。當(dāng)大于2.500 g/L時，兩種材料各濃度組中的葉綠素a均呈下降趨勢，且濃度越大其下降幅度越大；當(dāng)小于2.500 g/L時，兩種材料各濃度組中的葉綠素a均呈上升趨勢，且隨著濃度降低其上升幅度增加，但各濃度組上升幅度均低于對照組。

圖8 土槿皮提取物對銅綠微囊藻生長的影響Fig.8 Effect of Cortex Pseudolaricis on growth of M. aeruginosa

圖9 黃連提取物對銅綠微囊藻生長的影響Fig.9 Effect of Rhizoma Coptidis on growth of M. aeruginosa

3 討 論

目前，防治淡水水華的發(fā)生不僅是環(huán)境領(lǐng)域的熱點[8]，也是淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的焦點。隨著抑藻技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外研究者研究溶藻菌[9-11]、水生植物[12-13]、陸生植物[14-16]等抑藻技術(shù)，尤其是植物化感作用因其具有經(jīng)濟、高效、綠色環(huán)保的特點，備受國內(nèi)外學(xué)者親睞[17-18]。目前研究報道的具有抑藻作用的水生植物有很多種[19-22]，但利用水生植物直接抑制銅綠微囊藻的作用效果并不理想，可能因水生植物長期生長并適應(yīng)了該特定的環(huán)境從而不再產(chǎn)生對銅綠微囊藻的生長具有抑制作用的代謝產(chǎn)物[23]，也可能是其代謝產(chǎn)物長期在特定環(huán)境中抑藻效果逐漸消亡。目前，關(guān)于藥物材料對銅綠微囊藻控制的研究，主要集中在個別藥物材料的研究[24]。如潘琦等[25]研究美人蕉種植水對銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，以蒸餾水培養(yǎng)3 d收集獲得的美人蕉種植水對銅綠微囊藻的生長有明顯的抑制作用，且推斷美人蕉自身代謝產(chǎn)生的化感物質(zhì)可有效抑制銅綠微囊藻的正常生長。李娟等[26]發(fā)現(xiàn)，50 mg/L的H2O2能有效抑制銅綠微囊藻的生長，且對藻細(xì)胞的生理指標(biāo)等有很強的損傷效應(yīng)。汪小雄等[27]發(fā)現(xiàn)，浸泡5 d的荔枝落葉能抑制銅綠微囊藻的生長，且隨著時間延長，抑制效應(yīng)下降。而對于藥物材料篩選方面的研究報道卻較少[28]。因此，本試驗選擇了10種陸生藥物材料，用其浸提液進行了對銅綠微囊藻生長抑制的研究，發(fā)現(xiàn)不同的藥物材料浸提液對銅綠微囊藻生長表現(xiàn)出不同的抑制效果。具有較強抑藻作用的有蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、大黃、土槿皮、黃連，且2～5 d均可保持一定的抑藻率，說明這幾種材料均有持久抑藻的作用效果；其次是鐵觀音、大蒜；而大麥茶和仙鶴草在試驗期間其抑制率一直小于30%，可認(rèn)為這兩種材料對銅綠微囊藻生長的影響作用不明顯。另外，大蒜、大黃在前期抑制率較低，隨著時間延長其抑制率增幅較大，可能是由于浸提液中的有效成分需要一定的活化時間后才能發(fā)揮抑藻效果；蜜桔等柑橘皮含有豐富的生物活性物質(zhì)[29]，具有抗菌、抗病毒等作用[30]。柑橘、大蒜、鐵觀音都是人們常用的食物及飲品，較之土槿皮、黃連更加方便易得，綜上而言這幾種材料有望作為抑藻劑的制備材料。

為了進一步了解有效抑藻材料的最佳抑藻濃度，本試驗采用二倍稀釋的方法對銅綠微囊藻進行抑制試驗。柑橘皮類水提液對銅綠微囊藻有低促高抑的作用效果，這與梁宇斌等[31]的研究結(jié)果類似,臍橙皮提取液有低促高抑的作用效果，在質(zhì)量濃度為1.66 g/L時對銅綠微囊藻的生長有促進作用，而在3.31、6.62 g/L時對其具有明顯的抑制作用。本試驗得到的具體結(jié)果與之略有不同，可能是由于柑橘種類不同或所產(chǎn)地區(qū)不同所致。不同種類的中草藥材料對藻的影響可能起抑制作用，也可能起促進作用。劉東超等[32]研究了馬齒覓、桔梗、花粉等對亞心形扁藻生長的影響，表明其對亞心形扁藻有一定的促進作用，且作用的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.50%、0.75%和1.00%。周銀環(huán)等[33]研究了3種中草藥對綠色巴夫藻生長及葉綠素a含量的影響，結(jié)果表明添加一定量的當(dāng)歸、桔梗能提高綠色巴夫藻的生長及葉綠素a含量。當(dāng)歸、桔梗屬于營養(yǎng)性的藥物材料，仙鶴草也屬于該類材料，本試驗中雖然并未出現(xiàn)促進銅綠微囊藻生長的作用效果，但其抑藻效果并不明顯。土槿皮等具有殺菌、抗病毒的作用，本試驗中其對銅綠微囊藻的生長具有抑制作用效果。因此，選擇合適的抑藻材料對抑藻機制的研究及抑藻劑的研制非常重要。

4 結(jié) 論

(1) 從10種材料中篩選出8種有效抑制銅綠微囊藻生長的材料：大黃、黃連、土槿皮、蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、鐵觀音、大蒜，且抑藻的作用效果能夠持久。而大麥茶、仙鶴草不能有效抑制銅綠微囊藻的生長。

(2) 蜜桔皮等柑橘皮類水提液在低濃度時促進銅綠微囊藻的生長，具有低促高抑的作用效果。而黃連、土槿皮等藥物材料在低濃度時抑制作用較弱。

(3) 由于本試驗中的藥物材料浸提液本身具有顏色，考慮到應(yīng)用時對水質(zhì)環(huán)境的影響，各材料抑藻質(zhì)量濃度如下：蜜桔皮、蜜柚皮水提液為6.25 g/L；馬水桔皮水提液為3.13 g/L；鐵觀音、大黃浸提液及大蒜液為5.000 g/L；土槿皮、黃連提取物浸提液為2.500 g/L。參考文獻:

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