徐明怡，柴春榮，鐘海秀，倪紅偉

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040）

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植物光合碳同化途徑關(guān)鍵酶基因研究

徐明怡，柴春榮，鐘海秀，倪紅偉

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040）

摘要：植物按照碳同化方式的不同可分為C3途徑、C4途徑和CAM途徑。C4植物通過長期的進化形成了特有的高效光合基因。在高溫、高光強和低CO2濃度等條件下，C4植物的光合速率較C3植物更高。本文闡述了高等植物光合碳同化途徑中PEPC、PPDK、NADP-ME、RCA、SBPase 5個關(guān)鍵酶基因研究進展。

關(guān)鍵詞：C4途徑；C3途徑；PEPC；PPDK；NADP-ME；RCA；SBPase

高等植物的光合碳同化類型主要有3種：C3途徑，C4途徑和景天酸代謝途徑（CAM）。C3植物固定CO2的酶為1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）。C4植物是從C3植物進化而來的一種高光效種類。在高光強、高溫及低CO2濃度下，與C3植物相比，C4植物具有保持較高光效的能力。C4植物固定CO2的酶與C3植物不同，為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），PEPC對CO2的親和力高于C3植物中RuBPCase。在C4植物中，有很多酶類被涉及參與到C4光合碳同化途徑，PEPC、PPDK和NADP-ME是3個最為關(guān)鍵的酶。目前這3種酶已經(jīng)被研究得較為透徹，已從許多C4植物物種中分離出這3種關(guān)鍵酶，并分別將它們導(dǎo)入了不同種類的C3植物中，獲得較大進展，結(jié)果令人滿意。

1　PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）

PEPC是C4植物光合碳同化途徑的關(guān)鍵酶之一，葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有該酶。目前，許多植物物種的pepc基因都已被成功克隆。20世紀(jì)80年代，大腸桿菌（E.coli）、藍(lán)藻（Cyanobacterium）、谷氨酸棒桿菌（C. glutanicum）、黃花菊屬（Flaveria）、冰葉日中花（M. Crystallinum）、玉米（Z.mays）等物種的pepc基因就已被相繼克隆。20世紀(jì)90年代，科學(xué)家們又成功克隆出一批農(nóng)作物的pepc基因，如大豆（G.max）、馬鈴薯（S. tuberosum）、高粱（S.vulgare）、水稻等。

C4植物中的pepc基因家族有C4型（綠葉型）、根（莖）型、黃化葉型或C3型這三種類型，它們有著相似的基本結(jié)構(gòu)，已經(jīng)從高粱、玉米、黃花菊屬植物中克隆出pepc基因的3個家族成員的DNA或cDNA。Izui等［1］對玉米pepc基因進行研究，發(fā)現(xiàn)三種類型的pepc基因位于不同染色體上，C4型pepc基因位于9號染色體上，根型pepc基因在4號或5號染色體上，C3型pepc基因則在7號染色體上。

無論是生理學(xué)家還是育種學(xué)家，都對玉米的C4型pepc基因表現(xiàn)出極大的關(guān)注。與黃花菊屬多基因編碼的C4型pepc基因不同，玉米和高粱的C4型pepc基因是單基因編碼的。最先克隆出來的是玉米和Flaveria trinervia（黃花菊屬）中的C4型pepc基因的cDNA，隨后一些農(nóng)作物，如甘蔗和谷子的C4型pepc基因也被克隆。將高粱的C4型pepc基因的編碼區(qū)序列與玉米的進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)有88%的序列具有同源性，而與大腸桿菌進行比較，則僅有40%～50%的序列表現(xiàn)出同源［2］。對玉米C4型pepc基因的cDNA序列進行深入分析，發(fā)現(xiàn)C末端區(qū)域有大量的保守序列，推測部分的酶催化位點存在于該區(qū)域［3］。其他學(xué)者對玉米葉片的C4型pepc基因的一級結(jié)構(gòu)進行推測，認(rèn)為其C末端區(qū)域含有相對保守的片段，N末端則含有可變片段，并且認(rèn)為這兩個片段中可能分別含有活性中心和調(diào)節(jié)位點［4］。Jiao等［5］明確指出，N末端存在玉米PEPC的磷酸化位點（Ser-15），位于13～21片段中；C末端則含有活性中心的賴氨酸殘基（Lys-606）。

研究人員也對高粱的pepc基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)高粱葉片中含有E-PEPC型和G-PEPC型這兩種類型［6］，認(rèn)為高粱的pepc基因不同于其他pepc基因家族類型，其顯著特征表現(xiàn)在基因表達(dá)水平上，而不是它的一級結(jié)構(gòu)。除了不同組織器官和生長發(fā)育時期對pepc基因的表達(dá)有影響外，光照也會對其表達(dá)水平產(chǎn)生影響。

不同的基因編碼不同的pepc基因類型。有兩個不同的機制對高等植物的PEPC活性進行調(diào)控：一是通過位于N末端附近的保守絲氨酸殘基發(fā)生可逆蛋白磷酸化對PEPC活性進行調(diào)控。另一個機制是各種代謝因子會對PEPC活性產(chǎn)生抑制，如蘋果酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、天冬氨酸等。此外，蘋果酸可以抑制C4型PEPC磷酸化，將C4型pepc基因轉(zhuǎn)入C3植物后，內(nèi)源的胞質(zhì)NADP-ME可能會被pepc基因過表達(dá)而誘導(dǎo)出較高的活性，從而使得蘋果酸抑制PEPC活性的能力降低，大大提高了PEPC對PEP的親和力。

2　PPDK（磷酸丙酮酸二激酶）

Hatch和Slack［7］最先發(fā)現(xiàn)C4植物中能夠?qū)⒈岽呋D(zhuǎn)化成PEP的酶是PPDK。PPDK存在于葉肉細(xì)胞的葉綠體里，負(fù)責(zé)將運回葉肉細(xì)胞的Pyr催化，重新形成CO2受體PEP。這個反應(yīng)是限制C4光合碳同化途徑速度的關(guān)鍵步驟，因此，PPDK成為C4途徑中另一個被廣泛研究的關(guān)鍵酶。光可以準(zhǔn)確調(diào)控C4植物葉片中PPDK的活性。無光照條件下，PPDK活性下降；有光照射葉片時，其活性會迅速升高［8］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，ppdk基因有兩個類型的家族成員，即C4型和胞質(zhì)型。兩種類型的ppdk基因之間存在部分重疊［9］。它們是由兩個啟動子控制，從同一個基因的兩個不同起始位置開始轉(zhuǎn)錄。

大量研究證實，C3植物在逆境下長期馴化，進化出了C4植物。因此，C3植物與C4植物的ppdk基因同源性極高，只是在表達(dá)方式上存在著較大的差異。C3和C4植物的ppdk基因都有雙啟動子系統(tǒng)，這是它們的共同特征。它們的區(qū)別是第一個啟動子可以調(diào)控C4植物的ppdk基因進行表達(dá)，第二個啟動子是負(fù)責(zé)調(diào)控C3植物ppdk基因表達(dá)。研究人員已經(jīng)從不同物種的各種組織器官中將多種ppdk基因克隆出來，包括C4植物、細(xì)菌、C3植物、原生動物和CAM植物等。

植物的生長環(huán)境會對ppdk基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。Reiskind［10］的研究發(fā)現(xiàn)，C3植物在低CO2濃度條件下，有一些類似C4植物的光合碳同化特征可以被誘導(dǎo)出來，使得CO2補償點降低，光呼吸強度減弱。Agarie等［11］對荸薺（Eleocharis）的研究認(rèn)為，陸生條件下，荸薺進行C4植物的光合作用，ppdk基因的表達(dá)按照C4型進行；水生條件下，則按照C3植物的碳同化方式固定CO2，ppdk基因則按照C3植物進行表達(dá)。這表明，盡管陸生的ppdk1和水生的ppdk2具有極高的同源性，但卻是不完全一樣的。PPDK1蛋白是由cDNA的核序列編碼的蛋白質(zhì)。它有一個可能作為葉綠體轉(zhuǎn)移肽的特殊N端區(qū)，但是PPDK2蛋白卻沒有這個特殊區(qū)域，因此ppdk1和ppdk2編碼了兩種蛋白。葉綠體PPDK1是由ppdk1負(fù)責(zé)編碼，細(xì)胞質(zhì)PPDK2則由ppdk2編碼。荸薺這種兩棲類植物進化出了獨特的光合特征，這種進化方式為揭示C4植物光合碳同化途徑的基因表達(dá)機理提供了極具參考價值的重要依據(jù)。

3　NADP-ME（依賴于NADP的蘋果酸酶）

NADP-ME型C4植物的光合碳同化途徑的另一個關(guān)鍵酶存在于維管束鞘細(xì)胞的葉綠體中，它是NADP-ME，已經(jīng)從玉米、高粱和黃花菊屬植物中克隆出了C4型NADP-ME基因的cDNA。玉米和高粱的C4型me基因核酸序列具有最高的同源性，其同源性達(dá)到89%。高粱的me基因核酸序列與C3型的擬南芥僅有40%的同源性，同源性最低。玉米的葉片中NADP-ME同工酶有兩種，分別為62KD和72KD［12］；黃花菊屬中除了有62KD和72KD兩種NADP-ME同工酶外，還有一種為64KD的同工酶［13］。從玉米基因組中找到了3個與NADP-ME編碼序列或活性有關(guān)的位點。3號染色體的me3位點定位的是玉米葉片NADP-ME的cDNA；me1位點是定位的是胚芽鞘中的me基因，該位點與其在胚芽鞘中的累積有關(guān)，但不能與me3位點的葉片me基因的cDNA雜交；me2位點位于6號染色體長臂上，該位點定位的可能是一個玉米根中的me基因［14］。對黃花菊屬植物Flaveria進行研究發(fā)現(xiàn)，該植物具有3個me基因，me1、me2，其余的可能負(fù)責(zé)編碼葉綠體細(xì)胞質(zhì)中的NADP-ME。me1基因僅在葉片中表達(dá)，光可以對它的表達(dá)進行調(diào)控，其表達(dá)方式會影響它的C4光合特征；me2基因則在葉片和根中都會表達(dá)，但是表達(dá)量較低。因此有學(xué)者認(rèn)為me1基因負(fù)責(zé)編碼C4型的NADP-ME，me2基因則可能是負(fù)責(zé)編碼“管家”型NADP-ME［15］。

4　RCA （Rubisco活化酶）

所有光合生物進行光合碳同化的關(guān)鍵酶都是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 （Rubisco）。它負(fù)責(zé)催化RuBP的羧化和加氧反應(yīng)，并且能夠?qū)烧咧g的關(guān)系進行調(diào)節(jié)。植物的碳同化效率是由RuBP的羧化和加氧兩個反應(yīng)的比值來決定的。

為了提高RuBP的羧化和加氧反應(yīng)的比值，可以對Rubisco進行改造，以此來增強Rubisco固定CO2的效率。雖然Rubisco在葉片中的含量很高，大約占50%葉片可溶性蛋白，但其催化效率卻極低。研究發(fā)現(xiàn)，Rubisco為鈍化態(tài)時必須經(jīng)過活化才能具有羧化/加氧活性，能夠活化鈍化態(tài)Rubisco的這種酶就是Rubisco活化酶（RCA）。而Rubisco的活化程度能夠決定葉片的碳同化效率，是碳同化過程中的關(guān)鍵因子，因此，對RCA的研究極為重要。近年來，已對RCA的生理生化和分子生物學(xué)展開了研究，成為植物光合作用的重要研究領(lǐng)域之一。Martinez等［16］對高產(chǎn)玉米種群的Rubisco進行研究，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)玉米種群中有較高的RCA蛋白含量，因而使得Rubisco活性提高。 Jiang等［17］也發(fā)現(xiàn)超級稻的高產(chǎn)品種中Rubisco活性和RCA含量要高于普通水稻品種。這表明，RCA的含量和活性可以在一定程度上影響作物產(chǎn)量?？蒲腥藛T已經(jīng)從一些植物中成功克隆了rca基因，其蛋白提純和活性檢測以及rca基因的表達(dá)方面的研究取得了重大突破。

RCA是一種具有ATPase活性的可溶性的葉綠體蛋白，是由核編碼的蛋白質(zhì)。RCA一般是由2個亞基構(gòu)成，a亞基45kD，b亞基41kD，如擬南芥、菠菜、水稻、小麥、大麥、棉花等植物都有a亞基和b亞基。但是不同種類的植物，其RCA亞基的種類和數(shù)量也不相同，如衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、煙草和玉米，這3種植物的RCA就只有b亞基而沒有a亞基。但不管是同種植物還是不同植物，它們的RCA亞基抗體之間都可以相互交叉反應(yīng)。

RCA只能在含有葉綠體的組織器官中發(fā)生表達(dá)。有學(xué)者對植物的不同綠色組織做了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)RCA可以在擬南芥綠色的莖、葉、花、果實中表達(dá)，但在擬南芥黃化苗和根中卻檢測不到它的表達(dá)。此外，在水稻的莖、葉和蘋果葉片中，也發(fā)現(xiàn)RCA是可以表達(dá)的。這與Liu等［18］提出的Rubisco僅在含有葉綠素組織中出現(xiàn)特異表達(dá)的結(jié)論相一致。

5　SBPase（景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶）

卡爾文循環(huán)中的另一個關(guān)鍵酶就是景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（SBPase，EC 3.1.3.37）。它主要負(fù)責(zé)SBP的脫磷酰基作用，使CO2的受體RuBP再生。SBPase控制著Calvin循環(huán)中碳源的流向，因為它位于Calvin循環(huán)中同化和再生兩個階段的分支點上。盡管植物體內(nèi)該酶的含量很低，但是決定了碳元素的流通方向，是繼續(xù)進行循環(huán)再生成RuBP還是離開循環(huán)進入淀粉生物合成途徑［19］，它能使碳同化和淀粉生物合成之間達(dá)到平衡［20］。

SBPase的前體是具有N末端延伸的信號肽，其在細(xì)胞質(zhì)中合成，可以引導(dǎo)SBPase從細(xì)胞質(zhì)進入葉綠體［19］。SBPase是核編碼蛋白，對其氨基酸序列分析研究，發(fā)現(xiàn)SBPase有很高的同源性。不同植物的SBPase同源性可以達(dá)到80%左右，保守區(qū)域的同源性也較高，約為90%，成熟蛋白的同源性更高，可以達(dá)到98%以上。

光可以誘導(dǎo)SBPase的催化活性對其進行調(diào)節(jié)，并可以對其表達(dá)量進行調(diào)控［21］。研究發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下，SBPase不具有催化活性［21］，通過光合作用中產(chǎn)生的還原力可以調(diào)控它的光活化［22］。光活化可以在很短的時間內(nèi)完成，并且再度處于黑暗時，其活性又可被鈍化［24］。

SBPase的活性除了受到光的誘導(dǎo)和調(diào)控外，還會被Mg2+濃度調(diào)控，SBPase作用底物SBP-Mg2+濃度變化，SBPase的活性也隨之變化。此外，基質(zhì)的pH值、SBPase反應(yīng)產(chǎn)物S7P及甘油酸鹽也會對SBPase的活性起到調(diào)控作用［25］。

有人認(rèn)為SBPase具有更高級更復(fù)雜的調(diào)控方式。SBPase、GAPDH、PRKase及Fd這些酶形成了多酶復(fù)合體，一同定位在類囊體膜上，并具有一定功能。它們之間通過相互作用來提高酶的活化速率，從而使各酶之間對光誘導(dǎo)和光/暗變換形成了協(xié)調(diào)一致的適應(yīng)，以此來保證酶的活化速率是最大的［26］。另外，不同發(fā)育時期，如不同葉齡和不同葉位的葉片，SBPase對碳同化會產(chǎn)生不同影響。還有研究表明，即使同一葉片但不同位置的SBPase，其表達(dá)量也是有所差異的。

目前，小麥、菠菜、桑樹、擬南芥、水稻等許多植物物種的SBPase基因均已被成功克隆。人們希望通過分子生物學(xué)手段可以更深入地研究SBPase是如何調(diào)節(jié)植物的光合作用，以此驗證改變SBPase催化能力是否可以對植物光合效率起到促進作用。

6　展望

C4光合途徑中涉及基因協(xié)同表達(dá)，過程復(fù)雜。目前研究人員僅將C4高光效基因轉(zhuǎn)入C3植物中，但對這些轉(zhuǎn)入基因表達(dá)調(diào)控的研究很少。此外，酶活性還可能受到共價修飾、底物和協(xié)同因素的相互作用［27］，因此，在C3植物中引入真正的C4循環(huán)將最終需要對于葉片的組織學(xué)結(jié)構(gòu)做出相應(yīng)的改變。

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中圖分類號：Q945.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-8646（2016）10-0001-05

收稿日期：2016-03-28

基金項目：黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項“CO2倍增條件下三江平原小葉章光合蛋白分析及相關(guān)基因功能驗證研究”；黑龍江省科學(xué)院科學(xué)研究基金項目“不同CO2濃度條件下三江平原小葉章比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究”

作者簡介：徐明怡（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，博士，主要從事植物分子生態(tài)學(xué)研究。

通訊作者：倪紅偉（1964-），男，黑龍江雙城人，研究員，博士，主要從事濕地生態(tài)學(xué)、生物多樣性科學(xué)、恢復(fù)生態(tài)學(xué)等研究。

Study on the key enzyme genes of carbon fixation in photosynthetic organisms in plants

XU Ming-yi， CHAI Chun-rong， ZHONG Hai-xiu， NI Hong-wei
（Institute of Natural Resources and Ecology， HAS.， National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation， Harbin 150040， China）

Abstract：According to CO2assimilation mechanisms， plants can be classified into three types such as C3， C4， and CAM. C4plant acquired a series of high performance photosynthetic genes in evolution，which confers to more efficient photosynthesis than C3plant under adverse conditions such as high photo-intensity，temperature，and low CO2concentration.The research progress about five key enzyme genes in carbon fixation in photosynthetic organisms were expounded.

Key words：C4； C3； PEPC； PPDK； NADP-ME； RCA； SBPase