王沐蘭， 楊生超， 郁步竹， 李唯奇*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) / 云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)， 昆明 650201 )

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紅豆杉高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進(jìn)展

王沐蘭1， 楊生超1， 郁步竹2， 李唯奇2*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) / 云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)， 昆明 650201 )

紫杉醇是一種四環(huán)二萜酰胺類化合物，是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中提取分離出來(lái)的次生代謝物，是世界公認(rèn)廣譜、活性強(qiáng)的天然抗癌新藥。但直接從植物中提取紫杉醇的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，不僅產(chǎn)量低，且會(huì)對(duì)野生紅豆杉資源造成嚴(yán)重破壞，同時(shí)紫杉醇的化學(xué)全合成也由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜而不具備商業(yè)價(jià)值。與之相反，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有受外界影響少、生產(chǎn)成本低、次生代謝產(chǎn)物多、細(xì)胞生長(zhǎng)周期短的優(yōu)勢(shì)，是目前最具前景的紫杉醇生產(chǎn)方式。近年來(lái)隨著科研水平的不斷提升，紫杉醇無(wú)論在生理代謝調(diào)控、關(guān)鍵基因挖掘,還是新藥物制劑與劑型及其類似物的開發(fā)和運(yùn)用等方面,都取得了進(jìn)展，但要建立紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系，還必須和前人的研究經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合。該文對(duì)紅豆杉高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，主要包括前人對(duì)紅豆杉屬植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的外植體、培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件、褐化等問(wèn)題的研究，以及從代謝調(diào)節(jié)、培養(yǎng)方式、基因工程等多方面提高紫杉醇含量的最新進(jìn)展，最后總結(jié)了當(dāng)前研究的不足，并對(duì)今后通過(guò)多種組合方式來(lái)提高紫杉醇含量的生產(chǎn)途徑進(jìn)行了展望。以期促進(jìn)紅豆杉組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，為藥用資源保護(hù)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)與生產(chǎn)指導(dǎo)。

紅豆杉, 抗癌藥物, 細(xì)胞培養(yǎng), 懸浮細(xì)胞系建立, 紫杉醇誘導(dǎo)

紅豆杉中的紫杉醇是公認(rèn)的近三十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的最有效的抗癌藥物之一，它可以穩(wěn)定微管聚集并防止微管正常的生理解聚，“凍結(jié)”有絲分裂的紡錘體，抑制細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞活動(dòng)終止于對(duì)放療敏感的G2和M期，直至死亡(Schiff et al,1979)。紫杉醇在紅豆杉植物細(xì)胞中含量極低，即使是當(dāng)前公認(rèn)含量最高的短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹皮中也僅含0.069%(周忠強(qiáng)等,2001)。由于人們不合理的砍伐，樹木數(shù)量銳減，紅豆杉已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。雖然目前可以通過(guò)巴卡亭Ⅲ等前體物質(zhì)人工半合成紫杉醇，但是伴隨著如Cabazitaxel(Cheetham & Petrylak,2013)等一系列紫杉醇類新藥的研制，紫杉醇的使用藥譜更廣，市場(chǎng)需求更大。因此，使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是提高紫杉醇產(chǎn)量、紫杉醇藥源緊缺的當(dāng)務(wù)之急。

要建立紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系，必須與前人研究經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合，不斷優(yōu)化懸浮體系建立的相關(guān)環(huán)節(jié)，并通過(guò)分子生物學(xué)手段探索紫杉醇的合成過(guò)程，從細(xì)胞水平與分子水平共同促進(jìn)紫杉醇的生產(chǎn)。隨著基因組學(xué)檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步，目前已知的紫杉醇生物合成過(guò)程包括19個(gè)步驟，紫杉環(huán)碳環(huán)骨架形成、側(cè)鏈生物合成、紫杉烷環(huán)系統(tǒng)和側(cè)鏈酯化反應(yīng)三個(gè)階段，其中12個(gè)酶測(cè)序已經(jīng)完成，但仍有7個(gè)步驟依然未知(Cusido et al,2014)。本研究結(jié)合最新分子生物學(xué)進(jìn)展與前人研究經(jīng)驗(yàn)，從高產(chǎn)紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)建立以及紫杉醇誘導(dǎo)方法兩個(gè)方面，綜述了紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系建立的方法，并對(duì)今后提高紫杉醇含量的生產(chǎn)途徑進(jìn)行了展望。

1　高產(chǎn)紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)體系的建立

1.1 誘導(dǎo)愈傷組織

誘導(dǎo)出符合要求的愈傷組織是建立高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵，后續(xù)的繼代培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞系的建立要求愈傷組織具備高的分化能力、質(zhì)地松散、生長(zhǎng)旺盛，而紫杉醇的誘導(dǎo)則要求誘導(dǎo)出顏色淺、塊狀或顆粒明顯、次生代謝產(chǎn)物含量較高的細(xì)胞團(tuán)。在實(shí)驗(yàn)操作的過(guò)程中，愈傷組織的誘導(dǎo)主要受到外植體、培養(yǎng)基、激素等因素影響。

1.1.1 外植體紅豆杉的莖段、芽、假種皮、葉、胚、根均可用于愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷組織中紫杉醇的含量是建立高產(chǎn)的懸浮細(xì)胞系選擇外植體的重要依據(jù)。張芳芳等(2010)比較了南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)、曼地亞紅豆杉(T.media)和短葉紅豆杉不同外植體來(lái)源的愈傷組織的生長(zhǎng)特點(diǎn)和紫杉醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中以南方紅豆杉種胚為最佳外植體，其誘導(dǎo)的愈傷組織不僅紫杉醇含量高，而且污染率低。同時(shí)，Zhang et al(2000)總結(jié)前人的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)前紫杉醇產(chǎn)量在100 mg·L-1以上的細(xì)胞株系都來(lái)自于胚誘導(dǎo)的愈傷組織。

1.1.2 培養(yǎng)基誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織常見(jiàn)的培養(yǎng)基為MS、B5，但它們?cè)谟鷤M織誘導(dǎo)與紫杉醇積累中的作用不同。杜亞填等(2006)認(rèn)為南方紅豆杉的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS，B5則是愈傷組織的增殖、馴化和紫杉醇的最佳培養(yǎng)基。然而也有不同的研究結(jié)果報(bào)道。金貞蘭等(2010)以東北紅豆杉(T.cuspidata)莖為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最好的基本培養(yǎng)基是WPM，其次是B5。因此，可以采用階段培養(yǎng)法，根據(jù)不同種的紅豆杉在細(xì)胞培養(yǎng)的不同生長(zhǎng)階段可以選擇不同的培養(yǎng)基。

1.1.3 激素誘導(dǎo)愈傷組織的激素與植物內(nèi)源激素相關(guān)，葛麗麗等(2006)對(duì)紅豆杉內(nèi)源激素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)紅豆杉枝、葉中均含有ABA、IAA、GA、ZA，因此培養(yǎng)基中激素的種類、濃度及不同的激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)起著重要作用。在適宜濃度范圍內(nèi)的6-BA，對(duì)解除胚休眠和萌發(fā)具有顯著促進(jìn)作用。當(dāng)6-BA添加濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，紅豆杉的萌發(fā)率和成苗率分別較對(duì)照提高了30.6% 和17.5%(臧新等,2006)。翟雪霞(2009)的研究表明，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)以1.0 mg·L-12,4-D，1.0 mg·L-1NAA和0.5～1.0 mg·L-16-BA配合最佳。杜亞填等(2006)則發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA濃度高于0.4 mg·L-1時(shí)，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不利，單獨(dú)使用2 mg·L-1的2,4-D或與適宜濃度的KT、6-BA、KT+GA3相配合，有利于紫杉醇的合成。綜上所述，適宜濃度的2,4-D、6-BA、NAA、GA3、KT等都可促進(jìn)紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)，但在愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間均表現(xiàn)出較顯著差異，不同紅豆杉品種、不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)應(yīng)選用不同的培養(yǎng)基與不同濃度的激素組合。

1.1.4 培養(yǎng)條件愈傷組織的培養(yǎng)條件主要是指培養(yǎng)基內(nèi)的pH、光照、溫度等因素。紅豆杉愈傷組織對(duì)pH要求較小，培養(yǎng)基的pH值在4.8～7.8時(shí)生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異(Fett-Neto et al,1995)。同時(shí)，紅豆杉細(xì)胞適宜的生長(zhǎng)溫度范圍也較寬，在20～30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出愈傷組織。而光照條件對(duì)愈傷組織的影響較大，在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織與光照條件相比不僅生長(zhǎng)速度快，而且紫杉醇含量高。

1.1.5 添加物向培養(yǎng)基中添加適量的有機(jī)附加物能對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)率與紫杉醇的含量產(chǎn)生顯著影響。研究表明添加水解酪蛋白能顯著提高紫杉醇的含量，其濃度為0.1%時(shí)，紫杉醇含量最高(盛長(zhǎng)忠, 2000)。同時(shí)天然添加物椰子汁(甘煩遠(yuǎn)等,1996)、馬鈴薯汁(趙繼鵬,2013)也對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。然而能促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)的有機(jī)物僅是少部分，司徒琳莉和李振山(2001)發(fā)現(xiàn)附加0.1%的酵母菌膏、0.1%的玉米胚提取液、0.1%的紫杉外植體粉末、0.1%的土壤提取液或0.1%的牛肉蛋白胨浸膏，均對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著影響。

1.1.6 褐化的控制在愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中形成的酚類物質(zhì)易氧化，并會(huì)分泌出大量的棕色色素物質(zhì)使其顏色加深，這種現(xiàn)象稱為褐化。褐化抑制了細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性，擾亂了其正常代謝過(guò)程，且由于紫杉醇的次生代謝途徑與防御反應(yīng)相重疊，使得紅豆杉褐化程度加劇。在培養(yǎng)基中，加入適量的抗氧劑或吸附劑可達(dá)到抑制愈傷組織褐化的目的，如維生素C(何康,2006;李麗等, 2006)、活性碳(黃寧珍等,2007)、聚乙烯吡咯烷酮(鄭超,2013;趙繼鵬和楊叔慎,2014)、檸檬酸(趙繼鵬,2013)等。除此之外，通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的氧水平(胡凱等,2004)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)過(guò)程中的光照(于婭和陳嘉棋,2012)、激素組合(韓曉紅等,2013)，低溫預(yù)處理(高明波等,2011)等手段，也能一定程度上減少褐化。

2　細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及紫杉醇誘導(dǎo)

2.1 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇的最好途徑，用于懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器主要有機(jī)械攪拌式和氣升式(余響華等,2013)。目前，加拿大的Phyton Biotech、韓國(guó)的Samyang Genex和德國(guó)的Nattermann等世界一流制藥公司生產(chǎn)紫杉醇的生物反應(yīng)器已達(dá)75 000 L(Malik et al,2011)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方式的研究，當(dāng)前的熱點(diǎn)主要集中于細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。氧傳質(zhì)系數(shù)是表征反應(yīng)器操作性能的重要參數(shù)，是反應(yīng)器優(yōu)化設(shè)計(jì)和放大的關(guān)鍵，張長(zhǎng)銀等(2013)通過(guò)測(cè)定了紅豆杉懸浮細(xì)胞在10 L通氣攪拌反應(yīng)器中的氧傳質(zhì)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)通氣量對(duì)氧傳質(zhì)系數(shù)的影響大于攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)氧傳質(zhì)系數(shù)的影響，且隨著細(xì)胞生物量增加、氧傳質(zhì)系數(shù)減少、攝氧率增加，比耗氧速率呈現(xiàn)出先增加后緩慢下降的趨勢(shì)。反應(yīng)器中懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)還與細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的評(píng)價(jià)與控制相關(guān)。Zhang et al(2013)根據(jù)Logistic方程，建立了在15 L生物反應(yīng)器中的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，它由底物消耗的動(dòng)力學(xué)非結(jié)構(gòu)化模型、產(chǎn)物合成、流變行為和能量溢出四個(gè)部分構(gòu)成，其中降低能量溢出能夠優(yōu)化紫杉醇的誘導(dǎo)過(guò)程。與實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)不同，商業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器會(huì)產(chǎn)生巨大剪切力，它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝會(huì)造成顯著影響。Han et al(2013)研究了21種紫杉烷類物質(zhì)在生物反應(yīng)器剪切力作用下的代謝變化，結(jié)果表明除了紫杉醇和巴卡亭Ⅲ含量顯著降低外，許多與紫杉醇代謝途徑無(wú)關(guān)的紫杉烷類物質(zhì)也顯著降低。通過(guò)進(jìn)一步定位檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪切力會(huì)破壞其前體GGPP的環(huán)化過(guò)程，擾亂后續(xù)羥化與?；樞?，影響官能團(tuán)環(huán)氧丁烷環(huán)形成，從而限制了紫杉醇的合成。

2.2 代謝調(diào)節(jié)

2.2.1 添加誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子是誘發(fā)植物在抗病生理過(guò)程中產(chǎn)生植保素或引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的因子，是調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的重要手段。它能夠顯著提升紫杉醇及其衍生物的含量，具有專一性、快速性的特征(Khosroushahi et al, 2006)。根據(jù)其來(lái)源不同，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子與非生物誘導(dǎo)子。對(duì)新誘導(dǎo)子的篩選以及紫杉醇合成調(diào)控有關(guān)的信號(hào)分子與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是當(dāng)前熱點(diǎn)。

(1)生物誘導(dǎo)子：生物誘導(dǎo)子是植物在防御過(guò)程中為對(duì)抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，包括內(nèi)生真菌與有機(jī)體產(chǎn)生的各種代謝物(仇燕等,2003)。

內(nèi)生真菌是植物內(nèi)環(huán)境中一種重要的組成部分，它能夠選擇性地誘導(dǎo)藥用植物特定基因的表達(dá)，從而促進(jìn)藥用活性成分的積累(譚燕等,2013)。Jian et al(2013)從南方紅豆杉樹皮中分離出了192株內(nèi)生真菌，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，僅有真菌Diaporthephaseolorum能產(chǎn)生紫杉醇的前體物質(zhì)巴卡亭Ⅲ。Li et al(2009)將內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子美麗鐮刀菌與紅豆杉懸浮細(xì)胞在20 L的攪拌式共生生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明共生系統(tǒng)中的紫杉醇含量和分泌率分別是對(duì)照的2倍與6.8倍。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的使用加速了培養(yǎng)基內(nèi)的蔗糖消耗，這可能是由于內(nèi)生真菌通過(guò)轉(zhuǎn)化能量或激活膜上轉(zhuǎn)運(yùn)酶的方式促進(jìn)了紫杉醇向胞外分泌從而消耗了糖份。

茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)廣泛存在于植物防御信號(hào)的傳遞途徑中，它能將外部逆境信息傳遞給胞內(nèi)大分子產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成，是一種生物誘導(dǎo)子。MeJA的處理時(shí)間與濃度，都會(huì)顯著影響紫杉醇的誘導(dǎo)效果(Ketchum et al,1999;Khosroushahi et al,2006)。當(dāng)前研究表明，在MeJA誘導(dǎo)紫杉醇合成過(guò)程中，細(xì)胞色素氧化酶P450受到miRNA的調(diào)控，Qiu et al(2009)用Illumina測(cè)序研究紅豆杉細(xì)胞中的小RNA轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)用MeJA誘導(dǎo)紫杉烷合成后，3個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，14個(gè)表達(dá)下調(diào)。Li et al(2012)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)MeJA處理后的紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，得到了200 bp序列讀長(zhǎng)和46 581個(gè)非冗余重疊群，通過(guò)功能注釋，發(fā)現(xiàn)MeJA處理后的代謝途徑涉及茉莉酸、苯丙烷類和萜類化合物的生物信息學(xué)重建。但經(jīng)過(guò)MeJA處理的懸浮細(xì)胞，具有不同細(xì)胞系之間紫杉醇分泌不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，Patil et al(2012)通過(guò)qRT-PCR技術(shù)研究了不穩(wěn)定性的分子機(jī)制關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系紫杉醇合成途徑基因的表達(dá)量均劇烈增加，雖系間產(chǎn)量差異巨大，但基因表達(dá)量的差異不顯著。

冠菌素(Coronatine，Cor)是一種由菌株P(guān)seudomonassyringae分泌于細(xì)胞外，結(jié)構(gòu)及活性與茉莉酸相近的植物激素(梁垚,2011)。Cor能夠作為茉莉酸-異亮氨酸復(fù)合物(jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile)的強(qiáng)效抑制劑來(lái)啟動(dòng)植物防御反應(yīng)(Katsir et al, 2008)。Onrubia et al(2013)研究了Cor與MeJA對(duì)紅豆杉懸浮細(xì)胞系中紫杉醇的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cor誘導(dǎo)的紫杉醇及其前體物質(zhì)巴卡亭Ⅲ的含量為MeJA的4.8、3.6倍，較大地提高了萜類物質(zhì)的產(chǎn)量。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明雖然冠菌素與茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)效果差異較大，但兩者基因誘導(dǎo)表達(dá)模式相似。

環(huán)糊精(Cyclodextrin,CD)是6～12個(gè)D-吡喃葡萄糖基由α-1,4-葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖(沈海民等,2014)。它能夠作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形成環(huán)糊精包合物將不親水的次生代謝物運(yùn)送出胞外，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)次生代謝物向培養(yǎng)基的分泌。當(dāng)向培養(yǎng)基中單獨(dú)加入CD或茉莉酸甲酯時(shí)，其基因表達(dá)變化較小或表現(xiàn)不穩(wěn)定，而同時(shí)添加兩種物質(zhì)時(shí)會(huì)出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因BAPT和DBTNBT表達(dá)量增加，紫杉醇含量增加到對(duì)照的55倍(Sabater-Jara et al, 2014)。

隨著學(xué)科之間的不斷交融與滲透，交叉學(xué)科已經(jīng)成為科學(xué)發(fā)展的重要趨勢(shì)，這為紫杉醇誘導(dǎo)提供了新的視角。鯊烯素是存在動(dòng)物各組織器官中，終止細(xì)胞增殖的信號(hào)分子。Amini et al(2014)研究了鯊烯素對(duì)紫杉醇以及巴卡亭Ⅲ產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，鯊烯素的處理提高了紫杉醇合成過(guò)程關(guān)鍵基因ts的表達(dá)，紫杉醇以及巴卡亭Ⅲ產(chǎn)量顯著提高。同時(shí)H2O2含量也顯著增加，H2O2可能是紫杉烷類物質(zhì)合成過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)分子。

(2)非生物誘導(dǎo)子：非生物誘導(dǎo)子包括化學(xué)脅迫誘導(dǎo)子和物理脅迫誘導(dǎo)子，如稀土元素鈰(羅杰, 2003)、鑭(梅興國(guó)和田朝霞,2000)，金屬離子銅(胡蕾,2012)、銀(Zhang et al,2000)等。

Yang et al(2008)對(duì)稀土元素鈰促進(jìn)紫杉醇分泌的信號(hào)通路展開了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其通過(guò)激活磷脂酶A2的高水平表達(dá)，釋放LysoPC和自由脂肪酸，從而強(qiáng)化胞內(nèi)茉莉酸不斷積累，促進(jìn)紫杉醇的分泌。但鈰同時(shí)也激活了磷脂酶D，產(chǎn)生高濃度信使分子磷脂酸，啟動(dòng)下游凋亡途徑。因此，稀土元素的使用有一個(gè)最適使用范圍，高濃度會(huì)造成細(xì)胞活力下降，甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

二甲基亞砜(DMSO)是一種非質(zhì)子極性溶劑，它能夠溶解紫杉醇，并具有抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能(Sánchez et al,1999; Sharma et al,1998)。Kajani et al(2012)發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜不僅可以促進(jìn)紫杉醇產(chǎn)量的提高，還能增加細(xì)胞的紫杉醇的胞外釋放率，其最佳使用濃度為5%。

潘學(xué)武和董妍玲(2010)研究了脈沖及微交流電刺激對(duì)中國(guó)紅豆杉懸浮培養(yǎng)體系紫杉醇分泌與釋放的影響。結(jié)果表明，兩種電刺激均能不同程度的促進(jìn)了紫杉醇的誘導(dǎo)與釋放，其中在脈沖電刺激作用下，紫杉醇最高產(chǎn)量達(dá)到12.24 L·mg-1，為對(duì)照的7～9倍，胞外釋放率是對(duì)照的4～5倍。

O3是一種強(qiáng)氧化劑，它會(huì)迅速與細(xì)胞隙存在的H2O反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，ROS會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化，從而加速細(xì)胞衰老(Fuhrer & Booker,2003;Kangasjarvi et al,2005)。Xu et al(2011)發(fā)現(xiàn)暴露在O3環(huán)境中的中國(guó)紅豆杉懸浮細(xì)胞ABA含量與紫杉醇產(chǎn)量顯著上升。為了檢測(cè)ABA是否促進(jìn)了紫杉醇的產(chǎn)生，作者用ABA抑制劑氟化物進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABA的抑制不僅降低了O3對(duì)紫杉醇的誘導(dǎo)作用，而且具有劑量效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明ABA在O3誘導(dǎo)中紫杉醇含量上升的過(guò)程中具有重要作用。鑒于ABA和紫杉醇合成的緊密關(guān)系，Li et al(2012)通過(guò)過(guò)表達(dá)ABA合成途徑中的關(guān)鍵酶9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED)基因，也獲得了高產(chǎn)紫杉醇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。由此可見(jiàn)，雖然人們可以通過(guò)挖掘調(diào)控紫杉醇代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建多個(gè)關(guān)鍵酶基因組合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、高表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)激活紫杉醇生物合成的關(guān)鍵酶，但依靠基因工程來(lái)提高紫杉醇含量實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)依然需要其他因素的支撐。

(3)生物與非生物誘導(dǎo)子的協(xié)同作用：在植物的防御反應(yīng)中，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)信號(hào)途徑同時(shí)反應(yīng)的情況(Zhao et al,2005)，因此生物與非生物誘導(dǎo)子的聯(lián)合使用可能具有協(xié)同效應(yīng)，能共同促進(jìn)紫杉醇的生產(chǎn)。水楊酸是一種誘導(dǎo)多種植物對(duì)細(xì)菌、病毒產(chǎn)生抗性，參與植物對(duì)病原防衛(wèi)反應(yīng)的生物誘導(dǎo)子。而超聲波則通過(guò)增加膜透性，促進(jìn)細(xì)胞次生代謝物積累，是一種非生物誘導(dǎo)子。Rezaei et al(2011)研究了超聲波與水楊酸對(duì)紅豆杉懸浮細(xì)胞系紫杉醇含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量比兩種誘導(dǎo)子單獨(dú)使用時(shí)分別高出4倍與1.2倍，比對(duì)照高出8倍。但并不是所有生物與非生物誘導(dǎo)子的聯(lián)合使用都具有協(xié)同效應(yīng)，不同誘導(dǎo)子可能涉及不同的細(xì)胞防御機(jī)制，因此會(huì)出現(xiàn)相互干擾的情況。Onrubia et al(2010)用MeJA與水合硫酸氧釩共同處理紅豆杉懸浮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇最高產(chǎn)量的出現(xiàn)時(shí)間要比對(duì)照與單獨(dú)使用誘導(dǎo)子的情況延遲4 d，但其次生代謝物分泌量比單獨(dú)使用MeJA作為誘導(dǎo)子時(shí)低。

2.2.2 前體飼喂紫杉醇是一個(gè)基本骨架為紫杉烷類的三環(huán)二帖，生物合成以乙酰輔酶A為原料，經(jīng)甲瓦龍酸、牛兒醇、牛兒醇基牛兒醇基焦磷酸、紫杉二烯等一系列步驟，因此補(bǔ)加其生物合成過(guò)程的中間體可能促進(jìn)細(xì)胞中紫杉醇的合成。翟雪霞和李友勇(2009)發(fā)現(xiàn)甘氨酸、絲氨酸、L-苯丙氨酸三種前體物質(zhì)能提高細(xì)胞的紫杉醇合成能力，但會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)；與其不同的是D-苯丙氨酸，它不僅能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，而且顯著提高了紫杉醇合成能力，經(jīng)D-苯丙氨酸處理后，紫杉醇含量高達(dá)0.224%。 紫杉烷是紅豆杉懸浮培養(yǎng)中具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類產(chǎn)物的總稱，大部分都可以作為紫杉醇的半合成原料(程立超等,2013)。周忠強(qiáng)等(2005)發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉和丙酮酸鈉等前體物質(zhì)也能促進(jìn)紫杉烷的合成，其中苯甲酸鈉可使11-二烯產(chǎn)率提高245.2%。

2.2.3 添加抑制劑添加代謝旁路抑制劑能夠抑制某些分支代謝中關(guān)鍵酶的活性，從而使反應(yīng)朝有利于特定化合物的合成方向進(jìn)行。植物中存在兩條合成萜類代謝的途徑，胞漿中的甲羥戊酸途徑和質(zhì)體中的非甲羥戊酸途徑。劉智等(2005)采用甲羥戊酸途徑抑制劑洛伐它汀和非甲羥戊酸途徑抑制劑磷甘霉素，對(duì)紅豆杉懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)兩種途徑對(duì)紫杉醇的生物合成都有促進(jìn)作用，而非甲羥戊酸途徑貢獻(xiàn)較大。通過(guò)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)兩條途徑的關(guān)鍵酶5-脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑都能夠激活HMGR和DXR的轉(zhuǎn)錄，因此推斷兩種代謝途徑存在協(xié)同作用，共同為紫杉醇的生物合成提供前體。Wang et al(2007)的研究也表明在水楊酸存在條件下，DXP途徑的激活是紫杉醇前體IPP形成的主要原因。

2.2.4 前體、誘導(dǎo)子、抑制劑的協(xié)同誘導(dǎo)在適宜的濃度范圍內(nèi)，多種因子的協(xié)同誘導(dǎo)較單因子誘導(dǎo)更能提高紫杉醇產(chǎn)量。李干雄等(2008)檢測(cè)了在中國(guó)紅豆杉懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和紫杉醇積累的過(guò)程中，水楊酸、硝酸銀、氨基酸前體、D-果糖和硫酸鑭的添加時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)這些促進(jìn)劑的添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響，但都能顯著促進(jìn)紫杉醇的合成。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)蔗糖、檸檬酸三銨、水楊酸和氨基酸的組合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和紫杉醇積累具有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)初始添加1.67 mg·L-1硝酸銀，第9天添加10 g·L-1蔗糖與1 540 mg·L-1檸檬酸三銨顯著提高紫杉醇的合成能力，紫杉醇達(dá)到可達(dá)到39.2 mg·L-1(李干雄等,2010)。云南紫杉烷C是紅豆杉懸浮培養(yǎng)的主要次生代謝產(chǎn)物之一，高明波等(2010，2011)在特定時(shí)間用100 μmol·L-12, 3- 二羥丙基茉莉酸、20 g·L-1蔗糖和100 g·L-1XAD-7HP原位吸附進(jìn)行處理，使得云南紫杉烷C產(chǎn)量達(dá)(1 517±37)mg·L-1，是對(duì)照處理的11.1倍；同時(shí)作者采用RT-PCR揭示了云南紫杉烷C合成過(guò)程中6個(gè)關(guān)鍵酶基因的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明2, 3-二羥丙基茉莉酸的加入可使6個(gè)基因表達(dá)水平顯著提高，而吸附劑的加入雖然會(huì)延緩基因表達(dá)水平的提高速度，但能使基因表達(dá)維持在較高水平(高明波等,2010,2011)。

2.3 基因工程

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)紅豆杉轉(zhuǎn)基因器官的培養(yǎng)和目的基因的分離轉(zhuǎn)化已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展。Han et al(1994)用根癌農(nóng)桿菌B0542和C58感染紅豆杉幼莖，誘導(dǎo)出了可在不含植物激素培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)的冠癭瘤，并用Southern雜交檢測(cè)到T-DNA的存在，首次證明了紅豆杉可被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。苗莉云等(2013)通過(guò)構(gòu)建C-13苯丙素側(cè)鏈CoA-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因Bapt的表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中國(guó)紅豆杉細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞Bapt的mRNA表達(dá)量是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的1.26倍，HPLC檢測(cè)其紫杉醇含量高達(dá)為37.4 μg·g-1，是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞1.87倍。Zhang et al(2011)通過(guò)克隆10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因dbat，構(gòu)建其表達(dá)載體LBA4404和pCAMBIA1303 轉(zhuǎn)化中國(guó)紅豆杉細(xì)胞系，經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞dbat的mRNA表達(dá)量是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的(5.3±0.6)倍，紫杉醇產(chǎn)量約為(35±0.61) mg·g-1，是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的1.7倍。作者同時(shí)對(duì)3'-N-去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因Dbtnbt過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Dbtnbt基因能提高中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中的紫杉醇產(chǎn)量約37%(張鵬等, 2014)。抑制特異基因的表達(dá)也能促進(jìn)紫杉醇的合成，Li et al (2011)使用反義RNA技術(shù)抑制了合成紫杉醇側(cè)鏈的紫杉烷14β-羥基化酶，結(jié)果表明三種主要的C-14氧取代紫杉烷類化合物yunnanxane, taxuyunnanine C,sinenxan C產(chǎn)量下降，紫杉醇含量提高。

2.4 其他處理

為克服組織培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞具有的易變性的缺陷，科研人員把目光聚焦在了具有生長(zhǎng)和遺傳優(yōu)勢(shì)的植物干細(xì)胞上。Lee et al(2010)將去除木質(zhì)部的紅豆杉莖段在B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得了新生的干細(xì)胞。再將干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們生長(zhǎng)速度快、性狀穩(wěn)定，在添加了誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯、殼聚糖和前體物質(zhì)苯丙胺酸的條件下，細(xì)胞分泌了102 kg·mg-1的紫杉醇，而同期由莖段和胚誘導(dǎo)的愈傷組織僅僅分泌了23.39 kg·mg-1。且由于干細(xì)胞具有游離生長(zhǎng)、液泡分散的特性，對(duì)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、不同規(guī)格的氣升式、攪拌槳式生物反應(yīng)器均具有較高適應(yīng)性。

在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞通常由于分裂的不均一性以聚集體形式存在，而細(xì)胞聚集體的大小通常與紫杉醇的含量有關(guān)。Kolewe et al(2010)研制了一種利用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器來(lái)衡量細(xì)胞聚集體的方法，它可以讓實(shí)驗(yàn)者在組織培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，評(píng)價(jià)聚集體的大小及細(xì)胞的生物量的積累。且該方法比傳統(tǒng)過(guò)濾與圖像分析的方法操作更便捷、結(jié)果更為可靠。Bonfill et al(2006)將不同紫杉醇分泌能力的細(xì)胞系相混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)細(xì)胞系能夠促進(jìn)混合細(xì)胞系紫杉醇的分泌，但這種影響能力在多次繼代后效果下降。

3　問(wèn)題與展望

為提高細(xì)胞中紫杉醇的含量，前人對(duì)紅豆杉懸浮體系建立過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)、紫杉醇生物合成的分子機(jī)制已進(jìn)行了大量研究，對(duì)不同誘導(dǎo)子、前體物質(zhì)、抑制劑的使用也已趨于成熟，可從細(xì)胞、分子不同水平，添加誘導(dǎo)子、前體飼喂等不同方式共同促進(jìn)紫杉醇的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，云南紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉等不同種均能建立起穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系，但與此同時(shí)人類面臨的癌癥問(wèn)題也日益嚴(yán)峻。目前全球每年新增癌癥病人數(shù)約1 600萬(wàn)，死亡人數(shù)約720萬(wàn)，據(jù)《全球癌癥報(bào)告》預(yù)測(cè)，到2025年全球每年新增患癌病例將增至1 900萬(wàn)，到2030年將增至2 200萬(wàn)，這些癌癥病人均為紫杉醇的主要使用者。而紫杉醇作為醫(yī)院首選的抗腫瘤藥物，其供應(yīng)依然無(wú)法滿足市場(chǎng)需求(Malik et al,2011)。

通過(guò)當(dāng)前傳統(tǒng)的方法來(lái)提高紫杉醇含量，主要面臨兩個(gè)問(wèn)題：(一)大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，細(xì)胞表觀形態(tài)、生長(zhǎng)速率和紫杉醇合成能力在培養(yǎng)過(guò)程中均會(huì)發(fā)生顯著變化。Fu et al(2012)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)5 a懸浮培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞系，顏色由棕色變?yōu)榘咨驘o(wú)色，雖然生物量積累比率逐漸上升，但紫杉醇的產(chǎn)量逐漸降低。同時(shí)，由于懸浮細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基成分、細(xì)胞密度、溫度等環(huán)境因素非常敏感，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)微的變化都會(huì)對(duì)顯著影響懸浮系統(tǒng)的穩(wěn)定性(Kim et al,2004)。(二)誘導(dǎo)子的使用會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。紫杉醇是一種植保素，它在植物受到逆境脅迫時(shí)起防御作用，而誘導(dǎo)子則通過(guò)激活細(xì)胞的防御反應(yīng)來(lái)改變紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇的速率和積累，因此使用誘導(dǎo)子雖然可以在短期內(nèi)促進(jìn)紫杉醇含量提高，但不利用細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)。Patil et al(2014)發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯會(huì)破壞細(xì)胞從G1期到S期的過(guò)渡過(guò)程，減緩細(xì)胞周期的進(jìn)行，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而添加提取自Fusariumoxysprum的生物誘導(dǎo)子，則會(huì)在提升紫杉醇含量的同時(shí)直接造成細(xì)胞凋亡(Yuan et al,2002)。為解決這些的問(wèn)題，紫杉醇產(chǎn)量的提升可從以下幾個(gè)方向發(fā)展：(一)研究紅豆杉細(xì)胞在組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生遺傳變異的影響因素，揭示紫杉醇在細(xì)胞離體培養(yǎng)中發(fā)生變化的分子調(diào)控機(jī)制。當(dāng)前研究表明，長(zhǎng)期培養(yǎng)的低產(chǎn)量細(xì)胞通常具有較高的甲基化水平(Fu et al，2012)，而經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間限制生長(zhǎng)保存的紅豆杉愈傷組織在恢復(fù)處理過(guò)程中紫杉醇含量的降低也與基因的甲基化相關(guān)(Li et al,2013)。同時(shí)Li et al(2009)也發(fā)現(xiàn)，紫杉醇含量下降的細(xì)胞系其代謝途徑關(guān)鍵酶dxr、hmgr、ggpps、dbat轉(zhuǎn)錄水平降低。隨著研究的不斷深入，以分子生物學(xué)手段解決次生代謝物不穩(wěn)定性的問(wèn)題指日可待。(二)利用代謝組學(xué)，研究誘導(dǎo)子促進(jìn)作用與協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制，篩選低毒、高效、廣譜、專一的誘導(dǎo)子，以不影響后續(xù)培養(yǎng)的方式激活紫杉醇的防御響應(yīng)。內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ纳镎T導(dǎo)子，它不僅能在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物(Zhou et al,2010)，而且誘導(dǎo)效果高于普通誘導(dǎo)子(Li et al,2009)，可進(jìn)一步通過(guò)誘變育種等方式來(lái)提高菌種性能以促進(jìn)紫杉醇的分泌。(三)開發(fā)出性能更高的生物反應(yīng)器。大規(guī)模長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，環(huán)境不穩(wěn)定性是提升紫杉醇含量的阻礙之一，因此開發(fā)出即能建立穩(wěn)定環(huán)境滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求，又考慮產(chǎn)物運(yùn)輸與貯藏以減少紫杉醇在貯運(yùn)分解過(guò)程中損失的生物反應(yīng)器，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工程規(guī)?；a(chǎn)紫杉醇的必經(jīng)途徑。(四)采用基因工程技術(shù)合成紫杉醇。隨著紫杉醇生物合成分子生物學(xué)的深入研究，紫杉醇的生物合成過(guò)程已基本闡明，大部分功能與相關(guān)酶基因得到了克隆與表達(dá)。由于紫杉醇的合成主要受其下游調(diào)控，因此利用分子生物技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇，控制后生物合成特別是下游修飾過(guò)程以生產(chǎn)有特定性質(zhì)的代謝產(chǎn)物，是未來(lái)實(shí)現(xiàn)紫杉醇的高效率生產(chǎn)的重要途徑。

在紫杉醇生物合成過(guò)程研究不斷深入的條件下，其次生代謝調(diào)節(jié)途徑不斷清晰，屆時(shí)將前人建立懸浮細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)與最新生物技術(shù)相結(jié)合，將可以促進(jìn)紫杉醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，造福廣大癌癥病患者。

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Research progress in high yielding suspension cell lines and the induction of Taxol inTaxus

WANG Mu-Lan1， YANG Sheng-Chao1， YU Bu-Zhu2， LI Wei-Qi2*

( 1.YunnanResearchCenteronGoodAgriculturePracticeforDominantChineseMedicinalMaterials,YunnanAgricultureUniversity, Kunming 650201, China; 2.GermplasmBankofWildSpecies,KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences, Kunming 650201, China )

Taxol, a diterpene alkaloid secondary metabolite ofTaxusspecies, has been considered as one of the most promising anticancer drugs used for the treatment of several types of cancer. However, due to the difficulties in obtaining enough this compound fromTaxustrees, the traditional approach extracted directly from plants not only produces low yield, but also triggers serious damage to the wild resource ofTaxus. At the same time, the complex structure Taxol has impeded efforts to find a method to fulfill an economically feasible strategy via total synthesis. By constrast, cell culture ofTaxusis a potential alternative for the production of Taxol and analogue compounds in a large scale culture, which possesses a multitude of advantages such as high purity product of secondary metabolite, low production cost, short cell growth cycle and less influence from external factors. Huge efforts have been made to develop a more sustainable source of Taxol. The main target of ongoingTaxus-related research in recent years are on the regulation ofTaxusmetabolism, key genes mining, application and development in new pharmaceutical preparations. Different ways, including application of precursors and elicitors, optimizing of cultural conditions, screening of high yielding cell lines, optimization of growth and production media, have been already tested to improve the yield of Taxol in cultures ofTaxus. It is necessary to take into account the latest achievements based on empirical procedures to establish a high yielding system. In this review, we have summarized the latest endeavors to establish a high yield suspension cell line and increase its yield of Taxol, with a special focus on the key issues related to tissue culture ofTaxussuch as explants, culture medium, hormone treatment, culture conditions, browning and other issues. Developments for new and more effective elicitation treatments and the application of metabolic engineering to design new transgenic cell lines ofTaxuswith an improved capacity for taxane production have also been described. In the end, the article discusses the faultiness of current researches and prospects various combinational methods for raising Taxol content. This paper is helpful for promoting technology progress of tissue culture in Tuaxs and it will provide the guidance for the protection and application of medicinal resources.

Taxus, anticancer drugs, cell culture, suspension cell lines, Taxol induced

10.11931/guihaia.gxzw201412021

2014-12-15

2015-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070262)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31070262)]。

王沐蘭(1991-)，女，云南彌勒人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)，(E-mail)670428366@qq.com。

李唯奇，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参飳?duì)非生物脅迫響應(yīng)的信號(hào)過(guò)程，(E-mail)liweiqi@mail.kib.ac.cn。

Q943.1， Q946.889

A

1000-3142(2016)09-1137-10

王沐蘭，楊生超，郁步竹，等. 紅豆杉高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進(jìn)展 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1137-1146

WANG ML，YANG SC，YU BZ，et al. Research progress in high yielding suspension cell lines and the induction of Taxol inTaxus[J]. Guihaia， 2016，36(9):1137-1146