王　娟, 周　兵, 王欣欣, 吳秀娟, 厲　婷, 張文科, 劉亢丁

(1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院, 長(zhǎng)春 130021; 2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院物理化學(xué)系, 長(zhǎng)春 130012;3. 超分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

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Fe3O4納米粒子與慢病毒載體共同感染內(nèi)皮祖細(xì)胞的促血管新生和MRI示蹤的應(yīng)用

王娟1, 周兵2, 王欣欣3, 吳秀娟1, 厲婷1, 張文科3, 劉亢丁1

(1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院, 長(zhǎng)春 130021; 2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院物理化學(xué)系, 長(zhǎng)春 130012;3. 超分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

摘要采用化學(xué)共沉淀法制備了檸檬酸鈉修飾Fe3O4納米粒子(NPs), 使用胎牛血清(FBS)改善Fe3O4NPs的分散性. 實(shí)驗(yàn)表明Fe3O4NPs尺寸均勻, 且具有良好的穩(wěn)定性, FBS濃度小于5%(體積分?jǐn)?shù)) 時(shí), Fe3O4NPs無(wú)聚集沉淀; 在300 K下, 飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g); 核磁共振T2序列成像時(shí), 75 μg/mL Fe3O4NPs與慢病毒載體(LV)共同標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)成像效果良好; 而且EPCs具有穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的能力. 利用Fe3O4NPs與LV共同感染EPCs, 可有效促進(jìn)大鼠血管生成. 說(shuō)明修飾后的EPCs兼具核磁共振成像(MRI)示蹤和促血管生成雙重功能.

關(guān)鍵詞Fe3O4納米粒子; 內(nèi)皮祖細(xì)胞; 慢病毒載體; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 磁共振成像

近年來(lái), 磁共振對(duì)比成像技術(shù)與干細(xì)胞促進(jìn)血管新生的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用發(fā)展迅猛, 但評(píng)價(jià)細(xì)胞植入及定位標(biāo)記示蹤研究卻明顯滯后, 對(duì)細(xì)胞在活體內(nèi)的功能評(píng)價(jià)具有局限性. 因此, 開(kāi)發(fā)具有磁共振成像和促血管生成雙重功能的材料體系對(duì)促進(jìn)組織血管新生, 實(shí)現(xiàn)活體器官靶向示蹤具有重要意義.

Fe3O4納米粒子(NPs)在室溫下表現(xiàn)出超順磁性, 是磁共振成像(MRI) T2序列造影劑. Fe3O4NPs粒徑小, 穿透力強(qiáng), 弛豫率約為相同條件下Gd3+的7～10倍, 在水相中可以穩(wěn)定分散[1～4]. 在生物化學(xué)領(lǐng)域中, Fe3O4NPs主要通過(guò)2種方式干預(yù)生物功能, 一種是通過(guò)活體細(xì)胞標(biāo)記, 即NPs自身攜帶特異性抗體或多肽與細(xì)胞表面抗原結(jié)合或粒子通過(guò)細(xì)胞吞噬和胞飲方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi); 另一種是通過(guò)NPs活體注射, 被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性識(shí)別, 通常需要具有透膜能力的多肽或轉(zhuǎn)染試劑(如聚-L-賴(lài)氨酸、 精蛋白)的輔助作用來(lái)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)標(biāo)記[5～7], 再進(jìn)一步MRI示蹤, 實(shí)現(xiàn)在生物體內(nèi)的應(yīng)用.

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)為成體干細(xì)胞, 成熟后為內(nèi)皮細(xì)胞, 是脈管系統(tǒng)的重要組成部分, 直接促進(jìn)新生血管形成及內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù), 或通過(guò)大量分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及胰島素樣生長(zhǎng)因子等促進(jìn)局部缺血組織的血管新生[8,9]. VEGF是高度特異性的血管多功能生長(zhǎng)因子, 受體主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞, 具有促進(jìn)血管新生和成熟, 維持血管正常狀態(tài)及完整性等作用[10～13]. 慢病毒載體(LV)是目前基因治療的主要載體, LV攜帶目的基因修飾后的EPCs可優(yōu)化其血管新生能力, 促進(jìn)細(xì)胞增殖分化[14].

本文利用檸檬酸鈉的羧基在磁性Fe3O4NPs表面形成配位鍵, 得到具有良好穩(wěn)定性Fe3O4NPs, 經(jīng)胎牛血清(FBS)進(jìn)一步修飾, 改善Fe3O4NPs在水相中的分散性. 通過(guò)將Fe3O4NPs與LV室溫共孵育, 以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物[15], 同時(shí)攜帶VEGF基因, 然后以細(xì)胞胞吞噬的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用, 實(shí)現(xiàn)目的基因VEGF的蛋白表達(dá), 進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和磁性NPs的動(dòng)態(tài)示蹤雙重作用.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

氯化鐵(FeCl3·6H2O)、 氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、 氨水(NH3·H2O)和檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)均為優(yōu)級(jí)純, 購(gòu)于 Sigma-Aldrich公司. 攜帶血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP) 的HIV-1慢病毒載體, 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)參照文獻(xiàn)[16,17]方法合成. Anti-rat VEGF, CD34和β-actin抗體, 購(gòu)于A(yíng)bcam公司.

JEM-2100F型透射電鏡(TEM, 日本電子公司); VERTEX 80V型FTIR紅外分光光度計(jì)(Brucker公司); Nano Zetasizer 2000型動(dòng)態(tài)光散射儀(Malvern公司); SQUID-VSM 磁性測(cè)量系統(tǒng)(美國(guó)量子設(shè)計(jì)公司); TrioTim 3.0 T核磁共振儀(德國(guó)西門(mén)子公司); BX53熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1磁性Fe3O4NPs的制備將1.655 g FeCl3·6H2O和1.050 g FeCl2·4H2O溶于40 mL除氧的去離子水中, 于室溫、 氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌, 完全溶解后, 加入5 mL 25.57 mol/L 氨水, 溶液立即由棕黃色變?yōu)楹谏? 反應(yīng)10 min后, 加入4.4 g 檸檬酸鈉, 升溫至90 ℃, 攪拌陳化30 min, 冷卻至室溫. 磁性分離Fe3O4NPs, 用去離子水清洗3次至溶液為中性, 同時(shí)去除多余的保護(hù)劑, 產(chǎn)物用去離子水重懸, 加入FBS(體積分?jǐn)?shù)≤5%), 得到Fe3O4NPs溶液, 分散均勻, 于4 ℃冰箱恒溫保存.

1.2.2LV與不同濃度Fe3O4NPs感染EPCs觀(guān)察感染的EPCs治療大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血(MCAO)模型的促血管生成效果. LV對(duì)EPCs的最適感染復(fù)數(shù)(MOI)值為50 IU, 分別與含F(xiàn)e3O4NPs濃度為0, 2.5, 5, 10, 12.5, 25, 50, 75, 100和125 μg/mL的5%FBS分散液室溫共孵育30 min, 加入到EGM-2培養(yǎng)基(培養(yǎng)基內(nèi)Polybrene終濃度為10 μg/mL)中, 混合物感染細(xì)胞融合達(dá)到60%的EPCs, 經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后, 改用EGM-2全培養(yǎng)基. EPCs感染48 h后在熒光顯微鏡下觀(guān)察感染的EPCs的細(xì)胞狀態(tài)以及EGFP的表達(dá)情況; 收集感染72 h的EPCs, 用瓊脂糖固定EPCs懸液, 避免細(xì)胞沉降, 于MRI T2序列成像; 應(yīng)用Western blotting方法對(duì)VEGF蛋白的過(guò)表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)價(jià).

改良Zea Longa方法[18], 制備大鼠腦MCAO模型. MCAO模型建立24 h后, 尾靜脈注射上述感染的EPCs 2×106個(gè)/只, 以0.4 mg/mL多聚甲醛灌注大鼠心臟, 取腦, 石蠟包埋, 切片, 用免疫組化的方法, 進(jìn)行CD34標(biāo)記評(píng)價(jià)血管新生情況.

2結(jié)果與討論

2.1Fe3O4NPs的結(jié)構(gòu)表征

圖1為Fe3O4NPs的透射電鏡照片. 采用化學(xué)共沉淀法制備得到分散均勻的球形Fe3O4[圖1(A)], 高分辨透射電鏡(HRTEM)照片中間距為0.297 nm的晶面對(duì)應(yīng)于反尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4NPs的(220)晶面 [圖1(B)]. 從圖2(A)可以看出, Fe3O4NPs的粒徑為(8.1±1.7) nm. 電子衍射圖[圖2(B)]中, 在0.302, 0.255, 0.2111, 0.163和0.151 nm處的衍射環(huán)對(duì)應(yīng)Fe3O4的(220), (311), (400), (511), (440)晶面, 表明Fe3O4NPs為反尖晶石結(jié)構(gòu)[19].

元素分析(EDS)結(jié)果表明, 合成的Fe3O4NPs中含有Fe元素; 紅外光譜(FTIR)圖(圖3)中1629和1402 cm-1處出現(xiàn)檸檬酸根上的羧基伸縮振動(dòng)吸收峰, 檸檬酸根的羧基與Fe3O4NPs表面的鐵原子形成共軛作用[20]; 583 cm-1處為典型的Fe—O紅外特征吸收峰. 表明產(chǎn)物為檸檬酸根修飾的Fe3O4NPs.

2.2Fe3O4NPs的性能表征

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)試檸檬酸鈉包覆的Fe3O4NPs在體積分?jǐn)?shù)5%的FBS溶液中的粒徑大小及其分布, 結(jié)果表明粒徑主要分布在30～55 nm[圖4(A)], 比透射電子顯微鏡中NPs的粒徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果(6～10 nm)明顯增大, 這主要是由于水溶液中存在顆粒水合作用, 因此DLS測(cè)試的是NPs的二次粒度[21,22].

檸檬酸鈉修飾的Fe3O4NPs在pH =7.0的FBS溶液中帶負(fù)電荷,Zeta電位主要分布在(-25.0±4.6) mV[圖4(B)], 這是由于蛋白大分子帶負(fù)電荷[23], 有利于Fe3O4NPs在FBS溶液中的穩(wěn)定分散, 避免沉降導(dǎo)致的顆粒聚集. 通過(guò)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)在300 K 下對(duì)Fe3O4NPs粉末進(jìn)行磁響應(yīng)性表征. 由磁滯回線(xiàn)[圖4(C)]可見(jiàn)檸檬酸鈉修飾Fe3O4NPs的飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g), 即無(wú)剩磁, 也無(wú)矯頑力, 在室溫下呈超順磁性的特點(diǎn). 國(guó)外同類(lèi)商品化NPs如Ferumoxides的飽和磁化強(qiáng)度為63×10-3A·m2/g(63 emu/g), 而MR成像對(duì)比劑所要求的最低強(qiáng)度為41×10-3A·m2/g(41 emu/g)[24～26]. 本文制備的Fe3O4NPs的飽和磁化強(qiáng)度為74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g), 故能滿(mǎn)足MRI成像的要求.

2.3FBS修飾后的Fe3O4NPs的穩(wěn)定性

Fe3O4NPs濃度為3 mg/mL, FBS濃度為5%, 72 h內(nèi)Fe3O4NPs均勻分散, 為L(zhǎng)V與Fe3O4NPs共孵育提供穩(wěn)定液態(tài)環(huán)境. 將3 mg/mL的Fe3O4NPs分散在5%FBS和H2O中, 靜置6個(gè)月, 可見(jiàn)在H2O中, NPs出現(xiàn)少量的聚沉, 而FBS溶液中未見(jiàn)明顯沉降(圖5), 這是由于FBS溶液中蛋白大分子攜帶負(fù)電荷利于NPs穩(wěn)定分散, 并且FBS溶液中, 蛋白大分子結(jié)構(gòu)中的—COOH可與納米粒子形成共軛作用[27].

2.4MRI檢測(cè)

不同濃度Fe3O4NPs 的FBS溶液與LV共感染EPCs, 各組經(jīng)MRI掃描后在T2序列橫斷面成像, 結(jié)果示于圖6. 表明0, 2.5, 5, 10, 12.5, 25和50 μg/mL標(biāo)記組T2信號(hào)強(qiáng)度依次減低, 75, 100和125 μg/mL標(biāo)記組呈現(xiàn)較強(qiáng)的短T2低信號(hào), 75 μg/mL標(biāo)記組相對(duì)顯示效果較好. 影響MRI成像效果因素為Fe3O4NPs的粒徑、 外層包裹物的親水性和化學(xué)特性[28]. 共沉淀法制備檸檬酸鈉修飾的Fe3O4NPs經(jīng)FBS處理, 改善了NPs的粒徑分布和親水性, 表現(xiàn)出良好的成像效果.

2.5攜帶VEGF的LV與Fe3O4NPs共同感染EPCs的熒光表達(dá)

攜帶VEGF的LV與Fe3O4NPs [LV(VEGF)-Fe3O4NPs]共同感染的EPCs經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后, 慢病毒的EGFP在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá), 200倍視野中EGFP呈陽(yáng)性細(xì)胞可達(dá)70%左右(圖7), 表明感染后的EPCs有良好的熒光標(biāo)記作用.

2.6LV與Fe3O4NPs共同感染EPCs的VEGF蛋白表達(dá)

用LV(VEGF)-Fe3O4NPs、 攜帶VEGF的病毒載體[LV(VEGF)]和空病毒載體(LV)分別感染EPCs, 提取蛋白Western blotting, 檢測(cè)VEGF的表達(dá), 以β-actin為內(nèi)參對(duì)照. LV(VEGF)-Fe3O4NPs, LV(VEGF)與LV組存在顯著差異(P<0.05)(圖8), 表明感染后的EPCs可顯著過(guò)表達(dá)VEGF蛋白.

2.7感染后的EPCs治療MCAO的促血管新生作用

采用免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記MCAO大鼠腦組織的CD34陽(yáng)性細(xì)胞, 表示微血管密度(MVD), MVD計(jì)數(shù)按Weidener等[29]方法進(jìn)行. 計(jì)算每平方毫米(mm2)面積內(nèi)微血管的數(shù)量, 即MVD, 然后求其平均值. 結(jié)果顯示, 感染后的EPCs(EPCs-VEGF- Fe3O4NPs)治療組[圖9(A)]、 EPCs治療組[圖9(B)]和生理鹽水治療組[圖9(C)]間存在明顯差異(P<0.05). 在7 d時(shí), EPCs-VEGF-Fe3O4NPs治療組、 EPCS治療組和生理鹽水治療組的MVD分別為(270.1±13.6), (214.2±17.3)和(157.4±11.7)個(gè), 表明感染后的EPCs可使MCAO產(chǎn)生促血管新生作用.

3結(jié)論

采用化學(xué)共沉淀的方法, 以氯化鐵和氯化亞鐵為鐵源, 氨水為還原劑, 檸檬酸鈉作為保護(hù)劑, 制備了均一、 穩(wěn)定的Fe3O4NPs. 通過(guò)FBS對(duì)Fe3O4NPs進(jìn)一步修飾, 改善Fe3O4NPs在水相溶液中的分散性, 有利于與LV形成穩(wěn)定的復(fù)合體后感染EPCs, 實(shí)現(xiàn)了EPCs中VEGF蛋白的穩(wěn)定過(guò)表達(dá), 對(duì)促進(jìn)組織血管新生, 實(shí)現(xiàn)活體器官靶向示蹤具有重要意義.

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(Ed.: D, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81271294).

Preparation of Fe3O4Nanoparticles and Lentiviral Vector Infected EPCs for the Improvement of Angiogenesis and MRI Tracing?

WANG Juan1, ZHOU Bing2, WANG Xinxin3, WU Xiujuan1, LI Ting1,ZHANG Wenke3, LIU Kangding1*

(1.theFirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofPhysicalChemistry,CollegeofChemistry,3.StateKeyLaboratoryofSupramolecularStructureandMaterials,CollegeofChemistry,JilinUniversity,Changchun130012,China)

KeywordsFe3O4nanoparticles; Endothelial progenitor cell; Lentiviral vector; Vascular endothelial growth factor; Magnetic resonance imaging

AbstractFe3O4nanoparticles(NPs) modified with sodium citrate were preparedviachemical coprecipitation method and fetal bovine serum(FBS) could improve the dispersibility of Fe3O4NPs in FBS solution(volume fraction≤5%). At the temperature of 300 K, the saturation magnetization intensity of NPs reached 74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g); MRI T2 imaging of endothelial progenitor cells(EPCs) became better after being infected by 75 μg/mL of Fe3O4NPs and lentiviral vectors(LV); furthermore, EPCs could stably over express VEGF target gene. EPCs co-infected with Fe3O4NPs and LV, after being injected into caudal vein of focal cerebral ischemia rats could effectively promote angiogenesis. These results indicated the modified EPCs possessed both MRI tracing and angiogenesis, and therefore had potential application value in clinical therapy of cerebral ischemia.

收稿日期:2016-03-25. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-10.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 81271294)資助.

中圖分類(lèi)號(hào)O631; O647

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 劉亢丁, 女, 博士, 教授, 主要從事神經(jīng)病學(xué)腦血管病研究. E-mail: kangdingliu@163.com