嚴鋼莉　李朝武　聶海嶺　黎逢光　成勇　毛高峰　方煌　魏海燕　謝軍

430012　武漢，解放軍161醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞保護作用及機制研究

嚴鋼莉李朝武聶海嶺黎逢光成勇毛高峰方煌魏海燕謝軍

430012武漢，解放軍161醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【摘要】目的探討丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞可能的保護作用及機制。方法將PC12細胞分為5組：空白對照組(未加任何處理藥物)、Aβ誘導(dǎo)組(20 μmol/L Aβ處理組)和預(yù)處理組(分別加入濃度為5 ml/L、10 ml/L、20 ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24 h后加20 μmol/L Aβ)，通過CCK-8法檢測細胞增殖活性，流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡率，Hoechst 33258染色觀察PC12細胞核的改變，熒光分光光度計測定LDH、SOD、GSH及caspase-3活性水平，免疫組織化學(xué)方法觀察細胞色素C(Cyt-C)蛋白釋放水平，Western Blot檢測Bcl-2的表達水平。結(jié)果丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理對Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞損傷有較好的保護作用，其保護作用隨著藥物濃度的增加而增強。它能增加Aβ?lián)p傷的PC12細胞增殖活力，減少Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡，降低細胞核凝聚現(xiàn)象，抑制Aβ?lián)p傷的PC12細胞LDH釋放，增強SOD和GSH活性，促進Cyt-C在細胞內(nèi)表達，降低caspase-3活性，促進Bcl-2的表達。結(jié)論丹參川芎嗪注射液對Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞損傷具有與線粒體通路相關(guān)的保護作用，其保護作用與它抑制細胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、維持線粒體正常功能、抑制caspase-3的激活、促進抗凋亡因子Bcl-2的表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】丹參川芎嗪注射液AβPC12細胞凋亡神經(jīng)保護

阿爾茲海默病(Alzheimer,s disease，AD)是較常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進行性記憶能力下降、認知功能障礙和精神行為的異常，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。AD在老年期癡呆中發(fā)病率最高，約占癡呆患者的50%~60%。隨著人口老齡化的加速，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。

尸檢發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細胞出現(xiàn)大量凋亡、神經(jīng)元細胞外老年斑沉積和胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)，其主要是由于β-淀粉樣蛋白(β amyloid protein, Aβ)、自由基、興奮性氨基酸、神經(jīng)毒素、Ca2+超載、炎癥等有害因子的共同作用所致[2-3]。因此，國內(nèi)外均有將Aβ誘導(dǎo)具有神經(jīng)元細胞特性的PC12細胞作為病體外AD細胞模型[4]。

近年國內(nèi)有報道證實川芎嗪、丹參素均具有神經(jīng)保護作用，可參與神經(jīng)組織修復(fù)。川芎嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(TMP)，可透過血腦屏障，通過阻滯鈣離子通道、清除氧自由基、影響內(nèi)皮素和NO合成等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種作用，具有擴張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗脂質(zhì)氧化等作用[5-6]。丹參素可改善腦損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，抑制腦損傷對線粒體的損害；丹參素還可以穩(wěn)定線粒體膜電位(MMP)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的能量代謝抑制其凋亡[7-8]。

本研究擬以Aβ誘導(dǎo)PC12細胞損傷建立AD細胞模型，通過細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等實驗技術(shù)進行深入研究，探討丹參川芎嗪注射液對Aβ誘導(dǎo)PC12細胞損傷的可能保護作用及機制，為AD防治提供新的治療途徑。

1材料與方法

1.1試劑

丹參川芎嗪注射液(貴州拜特制藥有限公司，含鹽酸川芎嗪100 mg與丹參素2 mg)；Aβ25-35(美國Sigma公司)，-20℃保存，使用前7 d用去離子水配置(終濃度1 mmol/L)置于37℃水浴箱孵育；高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；AnnexinV-FITC、PI(碘化丙啶)、CCK-8、Hoechst 33258(上海碧云天生物公司)；LDH、SOD、GSH測試盒、caspase-3試劑盒(上海宸凜生物公司)，Cyt-C抗體、Bc1-2抗體、GAPDH抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及處理

PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株，購于中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，使用含10% FBS+100 U/ml青霉素的DMEM 5% CO237℃培養(yǎng)箱孵育。待細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)生長密度達單層70%，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，細胞傳代培養(yǎng)。按實驗要求確定細胞的接種密度。PC12細胞分組如下：(1)空白對照組未加任何處理藥物；(2)Aβ誘導(dǎo)組加入Aβ 20 μmol/L處理；(3)預(yù)處理組分別加入終濃度為5、10、20 ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24 h后再加入Aβ 20 μmol/L。同批實驗，每組設(shè)置3個復(fù)孔。所有的實驗在相同的條件下重復(fù)3次。

1.3細胞增殖活力測定

CCK-8測定各組細胞活力。取對數(shù)生長期細胞，以1.6×103/孔種植于96孔板。細胞分組處理后，每孔加入1 ul的CCK-8溶液，37℃下孵育1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量每孔的吸光度值。細胞活力以與空白組相比的百分比表示。

1.4FCM檢測

PC12細胞以2.5×105/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿，分組處理后收集，1500 r/min離心7 min，棄上清，預(yù)冷的PBS溶液沖洗沉淀2次，將細胞密度調(diào)整為1×106/mL；70%冰乙醇懸浮細胞4℃固定過夜，1500 r/min 4℃離心10 min，PBS沖洗沉淀2次，細胞重新懸浮于1 mL的結(jié)合緩沖液，加入AnnexinV-FITC 10 μL、PI 5 μL，4℃避光孵育30 min，即刻上機檢測。PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，流式細胞儀檢測分析。

1.5細胞核染色檢測

PC12細胞接種于蓋玻片，按分組要求處理，預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，4%多聚甲醛 4℃包埋45 min，PBS沖洗后加入Hoechst 33258溶液(10 μg/mL)，室溫避光放置5 min，用含抗熒光衰退功能的介質(zhì)包埋，熒光顯微鏡觀察拍照。正常的細胞核為彌漫且均勻的低強度熒光；凋亡的細胞核為濃染致密的固縮形態(tài)或者發(fā)出顆粒樣熒光。凋亡率=凋亡細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.6LDH、SOD、GSH活力測定

PC12細胞按1~2×105/孔接種于24孔板中，分組處理后PBS沖洗，1500 r/min離心7 min，收集細胞，預(yù)冷的PBS沖洗，懸浮于0.5 ml的緩沖液，4℃ 3000 r/min離心17 min。取上層液，使用全自動定量酶標(biāo)儀分別在波長440 nm、550 nm、412 nm處進行LDH、SOD及GSH活力測定，活力值使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.7caspase-3 酶活性檢測

按照Caspase-3試劑盒說明書操作。細胞分組處理后收集細胞，懸浮于細胞裂解緩沖液(25 μL/106個細胞)，冰上裂解10 min，4℃ 15000 r/min離心17 min，50 μL上清液、148 μL結(jié)合緩沖液(含DMSO 2 μL、0.1 mM DTT 10 μL)、2 μL DEVD-pNA(caspase-3顯色底物)混合后加入96孔黑板，避光孵育4 h。酶標(biāo)儀于波長405 nm處檢測吸光光度值。

1.8Cyt-C免疫細胞化學(xué)染色

PC12細胞常規(guī)爬片、藥物處理后，用預(yù)冷的PBS漂洗細胞3 min×2次，再次清洗、固定及封閉，加入1∶100的一抗，4℃過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的1∶100的二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；加入SABC復(fù)合物37℃孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色后使用蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明，最后封片觀察。光鏡下觀察。

1.9Western blotting

各組細胞裂解后提取總蛋白，根據(jù)申能博彩BCA法測定蛋白水平，蛋白進行定量后將上樣蛋白配置為每孔70 ug/10 uL。SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，室溫封閉1 h，加入一抗(1∶500)，4℃過夜。第2 d加入二抗HRP(1∶500)，室溫1 h，洗滌3次后，使用ABI Veriti顯影、拍照。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1丹參川芎嗪注射液對Aβ引起的PC12細胞增殖活力的影響

與未處理的空白組(空白對照組)PC12細胞比較，5、10、15、20、25、30 μmol/L劑量組細胞活力分別下降了19.3%、30.4%、56.5%、26.9%、19.7%(P<0.05)(圖1A)。與Aβ組比較，5、10、20 ml/L丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組(預(yù)處理組)細胞活性分別上升16.2%、30.4%、36.6%(P<0.05)(圖2)。

2.2丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞凋亡率的影響

空白對照組大多為正?；罴毎?，凋亡細胞占16.8%；Aβ 15 μmol/L處理后凋亡細胞增加至56.4%(P<0.05)；丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組凋亡細胞數(shù)目減少，分別為34.0% (P<0.05)、23.2%(P>0.05)和19.2%(P>0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組凋亡率分別增加22.4%、33.2%、37.2%(P<0.05)(圖2)。

圖1 PC12細胞活力 A為不同濃度Aβ對PC12細胞活力影響;B為不同水平丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞活力影響;與空白對照組比較,*P<0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

圖2 PC12細胞凋亡率 與空白對照組比較,*P<0.05,與空白對照組比較,ΔP>0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.3丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞核的影響

空白對照組細胞保持正?；钚约毎募毎藸顟B(tài)(圖3A)；Aβ誘導(dǎo)組中大多數(shù)PC12細胞發(fā)生凋亡，出現(xiàn)細胞核凝聚、DNA斷裂 (圖3B)。丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組(10 ml/L)PC12細胞核凝聚現(xiàn)象較Aβ誘導(dǎo)組明顯減弱，即凋亡細胞減少，活性細胞數(shù)目增多(圖3C)。

2.4丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞的LDH、GSH、SOD活力的影響

與空白對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組LDH釋放增加，SOD、GSH活性下降，P<0.05；與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組LDH釋放減少，而SOD和GSH活性明顯升高，且該改變與丹參川芎嗪注射液水平有關(guān)(P<0.05)(圖4)。

圖3 細胞核Hoechst33258染色 A為空白對照組;B為Aβ誘導(dǎo)組;C為10ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24h后加入15μmol/LAβ

圖4 LDH、GSH、SOD活力測定 與空白對照組比較,*P<0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.5丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞Cyt-C免疫活性影響

空白對照組細胞形態(tài)良好，Cyt-C免疫化學(xué)染色呈淡棕黃色，均勻分布于胞質(zhì)及突起內(nèi)；Aβ誘導(dǎo)組部分細胞變圓、皺縮，Cyt-C在細胞內(nèi)表達增強，呈深棕黃色；相對于Aβ誘導(dǎo)組，丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組Cyt-C在細胞內(nèi)著色變淺,細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)也有改善(圖5)。

2.6丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞caspase-3活性的影響

與空白對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組、丹參川芎嗪注射液(5、10 ml/L)預(yù)處理組細胞caspase-3活性升高(P<0.05)，丹參川芎嗪注射液(20 ml/L)預(yù)處理組細胞caspase-3活性變化不顯著(P>0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組細胞caspase-3活性明顯下降(P<0.05)，且下降程度與丹參川芎嗪水平有關(guān)(圖6)。

圖5 Cyt-C免疫組織化學(xué)化染色 A為空白對照組;B為Aβ誘導(dǎo)組;C為10ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24h后加入15umol/LAβ

圖6 caspase-3活性測定 與空白對照組比較,*P<0.05,ΔP>0.05,與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.7丹參川芎嗪注射液對Aβ?lián)p傷的PC12細胞Bcl-2的影響

與空白對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組和丹參川芎嗪預(yù)處理組Bcl-2的表達水平均出現(xiàn)下降(P<0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5 ml/L)預(yù)處理組Bcl-2的表達水平差異不明顯(P>0.05)；丹參川芎嗪注射液(10、20 ml/L)預(yù)處理組Bcl-2的表達水平顯著增加，其增加幅度隨丹參川芎嗪注射液的藥物水平增加而增加(P<0.05)(圖7)。

圖7 各組Bcl-2表達水平 與空白對照組比較,*P<0.05;△P>0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

3討論

盡管近些年來生物化學(xué)、分子生物學(xué)、流行病學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科發(fā)展使我們更進一步認識AD，但對AD的病因和發(fā)病機理還存在很多不明因素。通常認為AD是多基因遺傳疾病，發(fā)病原因與年齡、性別、能量代謝障礙、免疫功能異常、內(nèi)分泌、感染等遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。在各種AD發(fā)病學(xué)中β淀粉樣蛋白學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙學(xué)說是AD發(fā)生發(fā)展普遍公認的機制。最近研究提示，Aβ可與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA受體)結(jié)合，從神經(jīng)細胞外轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，再與A單體裝配形成寡聚體Aβ，進一步促進tau蛋白的過度磷酸化和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)，引起胞內(nèi)Ca2+超載、線粒體氧化損傷及氧化應(yīng)激[9-11]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液孵育后細胞增殖活力增加、凋亡減少，表明Aβ誘導(dǎo)的細胞損傷受到丹參川芎嗪注射液的抑制。同時本研究發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪注射液孵育后受損細胞的SOD、GSH活性提高，而LDH的釋放減少。該結(jié)果表明丹參川芎嗪注射液的神經(jīng)元保護作用與細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，其可以激活細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的防御反應(yīng)，清除異常增多的活性氧成分。

很多研究顯示，在神經(jīng)退行性疾病患者的海馬區(qū)存在有caspases蛋白的活化。Caspases為半胱氨酸蛋白酶家族，在啟動神經(jīng)元異常凋亡途徑中有重要影響，因此是AD發(fā)病的主要途徑之一[12-13]，其中Caspase-3被認為是促進細胞死亡的較為常見的細胞內(nèi)蛋白酶。內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的凋亡途徑亦在細胞凋亡過程中起其關(guān)鍵性作用[14-15]。多種刺激因子如淀粉樣蛋白β、腫瘤壞死因子α、活性氧、化學(xué)治療、DNA損傷劑和輻射等均能損傷線粒體，增加線粒體膜通透性(MOMP)，促進因子如Cyt-C、Omi等從線粒體內(nèi)釋放到細胞液，直接或間接啟動Caspases相關(guān)凋亡途徑[16-18]。Bcl-2家族是線粒體凋亡的重要調(diào)控因子。Bcl-2能改變MOMP，減少凋亡促進因子的釋放[19]；Bcl-2能降低BAX介導(dǎo)的Cyt-C釋放、抑制Caspase激活、抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白(AIF)從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞核[20-21]。同時Bcl-2還能促進氧化應(yīng)激下的DNA修復(fù)[22]。因此，本研究可以認為抑制Caspases激活、促進凋亡抑制蛋白Bcl-2的高表達可減少細胞凋亡，促進受損神經(jīng)元細胞的功能恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ?lián)p傷PC12細胞后Caspase-3活性明顯增強，細胞核出現(xiàn)凝聚，Cyt-C表達增強，而丹參川芎嗪注射液預(yù)處理后Caspase-3活性被顯著抑制，細胞核凝聚現(xiàn)象改善，Cyt-C表達減少，凋亡抑制因子Bcl-2的表達量隨著丹參川芎嗪注射液水平增加而增加。該結(jié)果說明丹參川芎嗪注射液預(yù)處理對PC12細胞的神經(jīng)保護作用可能通過抑制Caspases-3活性、改善MMOP、促進Bcl-2表達等途徑實現(xiàn)。

綜上所述，丹參川芎嗪注射液具有強大的抗氧化、抗凋亡活性，對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有著多重的保護作用，也許可以用來治療如AD等神經(jīng)變性疾病。

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(2015-09-07收稿)

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.01.005

Protective effects and mechanism of salvia and TMP injection on Aβ-induced injury in PC12 cellsYanGangli,LiChaowu,NieHailing,etal.DepartmentofNeurology,TheChinesePLA161thHospital,Wuhan430012

【Abstract】ObjectiveTo observe the possible protective effect and mechanism of Salvia and TMP injection on Aβ-induced injury in PC12 cells.MethodsPC12 cells were divided into five groups: control gruop, Aβ-induced Injury in PC12 cells (Treatment with 20 μmol/L Aβ alone); Pretreatment group ( Pretreatment with 5ml/L, 10ml/L, 20 ml/L Salvia and TMP Injection on Aβ-induced Injury in PC12 cells). Then the cell viability was measured by CKK-8, apoptotic rate was measured by flow cytometry, variation of nucleus was measured by Hoechst33258 dye, and the vitality of LDH, SOD, GSH and caspase-3 were measured by the kits, respectively. Immunohistochemical method was used to observe Cyt-C protein release. And western blot was used to detecting Bcl-2 protein expression.ResultsSalvia and TMP injection (5,10,20 μmol/L) pretreatment can protect the PC12 cells injuried by Aβ which protective effect was increased with higher drug concentration. Salvia and TMP injection can promote cells proliferation, reduces apoptosis and nuclei condensation, inhibit LDH release, increase SOD, GSH activation, decrease caspase-3 activation, help Cyt-C and Bcl-2 generation.ConclusionSalvia and TMP injection have neuroprotective effect of PC12 cells induced by Aβ which was related with anti-oxidative stress, maintenance of mitochondrial function, improvement of the anti-apoptotic factor Bcl-2 and inhibition of caspase-3 activation. Salvia and TMP injection may be used to cure neurodegenerative disease such as AD.

【Key words】Alvia and TMP injectionAβPC12 cellsApoptosisNeuroprotection

【中圖分類號】R741

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)01-0015-06

基金項目：湖北省衛(wèi)計委科研基金資助項目(批準(zhǔn)號WJ2015MB130)