張 志，王琪琪，賀 東

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161601)

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黃瓜抗霜霉病的分子標(biāo)記及相關(guān)基因的研究進(jìn)展

張 志，王琪琪，賀 東

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161601)

從黃瓜霜霉菌的病原菌和發(fā)病特點(diǎn)、發(fā)病規(guī)律、影響發(fā)病的因素、分子標(biāo)記、抗霜霉病基因相關(guān)的分離、鑒定等方面綜述了黃瓜抗霜霉病的相關(guān)分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望。

黃瓜霜霉病；基因；分子標(biāo)記；克隆

霜霉病是世界上危害瓜類作物的主要葉部病害之一，黃瓜霜霉病(Cucumber downy mildew)是危害70多個(gè)國家黃瓜生產(chǎn)的一種世界性病害。霜霉病是包括白粉病、枯萎病在內(nèi)的三大病害之一。黃瓜霜霉病是由真菌門鞭毛菌亞門古巴假霜霉菌侵染引起的一種世界性病害，在適宜條件下，葉片發(fā)黃、枯死，病情發(fā)展迅速，產(chǎn)量虧損嚴(yán)重，給黃瓜生產(chǎn)帶來巨大威脅。近年來，關(guān)于黃瓜抗霜霉病的分子生物學(xué)研究日益增多，在抗病基因分離、鑒定、分子標(biāo)記等方面取得了一定進(jìn)展。筆者對(duì)黃瓜抗霜霉病的分子標(biāo)記及相關(guān)基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望。

1　霜霉病的病原菌和發(fā)病特點(diǎn)

1.1病原菌古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubnsis(berk.etCurt.)Rostov)是一種專性寄生菌，屬于鞭毛菌亞門霜霉菌目和假霜霉屬。病菌的孢子囊梗無色，從氣孔伸出，單生或2～4根束生，上部呈3～5次銳角分枝，分枝末端著生一個(gè)檸檬形或卵形孢子囊，孢子囊可釋放出游動(dòng)孢子或萌發(fā)長出芽管，變?yōu)閳A形休止孢子，萌發(fā)芽管，侵入寄主，產(chǎn)生孢子囊適宜溫度15～20 ℃，萌發(fā)適宜溫度15～22 ℃[1]。

1.2發(fā)病特點(diǎn)霜霉病侵染以葉片為主。苗期發(fā)病，子葉上起初出現(xiàn)褪綠斑，不規(guī)則形狀，且病斑逐漸呈黃色，隨著病情發(fā)展子葉很快變黃，枯干；成株期發(fā)病，葉片上初現(xiàn)淺綠色水浸斑，擴(kuò)大后黃綠色轉(zhuǎn)淡褐色，呈多角形，后期病斑匯合成片，由葉緣向上卷縮，全葉干枯，嚴(yán)重時(shí)全株葉片枯死[2]。2個(gè)時(shí)期潮濕時(shí)均生出灰黑色霉層于葉背面病斑上。

2　發(fā)病規(guī)律

氣流和風(fēng)雨是霜霉病菌孢子進(jìn)行傳播的主要媒介，且對(duì)空氣濕度要求較高，棚內(nèi)有結(jié)露，葉面有水滴是發(fā)病的必要因素。葉片上有水滴，15 ℃下孢子囊經(jīng)1.5 h即可萌發(fā)，游動(dòng)孢子2.0 h即可萌發(fā)侵入引起發(fā)病，在形成病斑后，空氣濕度與孢子囊形成的速度和數(shù)量成正比，在葉面有水滴和飽和濕度的條件下，隨著寄主葉組織充水，病斑發(fā)展加劇，可產(chǎn)生大型的孢子囊，否則孢子囊不能萌發(fā)，且2～3 d后即喪失萌發(fā)能力，霜霉病發(fā)病的適宜溫度是15～24 ℃，低于15 ℃或高于28 ℃不易發(fā)病，溫度越高，越不易發(fā)病[3]。

3　影響發(fā)病的因素

3.1品種間抗病性、種植環(huán)境黃瓜品種間發(fā)病有差異。一般情況下，較為感病的品種熟性較早、耐低溫，相對(duì)較抗病的品種較晚熟、耐熱性強(qiáng)。地勢(shì)較高、排水良好的地塊適宜黃瓜種植，同時(shí)施足底肥，合理追施氮、磷、鉀肥，可降低霜霉病的發(fā)病概率。

3.2光照、溫度和濕度在光照與黑暗交替的環(huán)境條件下產(chǎn)生孢子最多，而在持續(xù)光照下，幾乎無孢子囊產(chǎn)生[4]。黃瓜霜霉病屬于高濕病害，孢子囊在葉面有水滴或水膜時(shí)才能萌發(fā)，石延霞等[5]研究表明，葉片接種病菌后保濕2 h可引起發(fā)病，病菌侵入寄主后，環(huán)境濕度條件對(duì)病害的發(fā)展影響不大。Cohen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，孢子囊產(chǎn)生和侵染的適宜溫度為15～20 ℃。

3.3顯癥天數(shù)與產(chǎn)孢潛能的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，顯癥后天數(shù)與累積孢子囊量之間呈拋物線型相關(guān)，活體葉片單位面積上產(chǎn)生的孢子囊量比離體葉片多[7]。且顯癥后天數(shù)與累積孢子囊量、病斑面積間存在較高相關(guān)性[6-9]。

4　黃瓜抗霜霉病基因分子標(biāo)記的研究

黃瓜基因組較小，約為3×105kb。Kennard等[10]報(bào)道了2個(gè)與黃瓜抗霜霉病基因連鎖的RFLP標(biāo)記CsC230/EcoRI和CsC593/DraI，與抗性基因的遺傳距離分別為9.5和17.7 cM。Horejsi等[11]鑒定出一個(gè)與控制霜霉病基因dm緊密連鎖的RAPD標(biāo)記BC5191100，遺傳距離為9.9 cM。丁國華等[12]以L18-10-2(感霜霉病黃瓜)和129(抗霜霉病黃瓜)為親本構(gòu)建F2代分離群體，獲得了一個(gè)與霜霉病抗病基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記SBSP18561，其與抗性基因的遺傳距離為7.85 cM，并將該RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記SSBSP18494。但上述研究的分子標(biāo)記與黃瓜霜霉病抗性基因間的遺傳連鎖距離均較遠(yuǎn)，劉苗苗[13]構(gòu)建了8個(gè)連鎖群，包括39個(gè)標(biāo)記，總長度為287.4 cM，平均圖距為7.37 cM，每個(gè)連鎖群的標(biāo)記數(shù)為2～11個(gè)，共定位到5個(gè)QTLs(dm1.1、dm3.1)，貢獻(xiàn)率最大為19.6%。趙振國[14]獲得了與ILDM10-4抗性基因(ILdm)連鎖的3個(gè)SSR標(biāo)記：SSR00772、SSR03529、SSR15321，它們與目標(biāo)基因的遺傳距離分別為3.8、6.0、16.7 cM，其中，標(biāo)記SSR00772的遺傳距離小于5 cM，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，3個(gè)標(biāo)記位于抗霜霉病基因兩側(cè)，為其精細(xì)定位及圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。孟攀奇等[15]采用BSA法篩選到1個(gè)AFLP引物組合P11M70，其在抗病池和感病池間表現(xiàn)為多態(tài)性，抗病池和抗病親本均具有大小約304 bp的特異譜帶，感病池和感病親本均擴(kuò)增出大小約為301 bp的特異片段，經(jīng)F2單株驗(yàn)證及連鎖分析，該特異片段與霜霉病抗病相關(guān)基因相連鎖，連鎖距離為5.22 cM。

5　黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因的研究

對(duì)于抗霜霉病基因的克隆，目前通常以獲得抗病基因同源序列(RGA)為入口，根據(jù)抗病基因間相似序列設(shè)計(jì)簡并引物，從植物基因組中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與抗病基因緊密連鎖，有較高的同源性[16]。

李建武[17]采用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的正、反向差減文庫，應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行篩選，從正、反向差減文庫中分別得到了60和26個(gè)非重復(fù)序列片段(singleton ESTs)，其中，正向差減文庫的singleton ESTs涉及12種功能類別和未知功能，比較分析發(fā)現(xiàn)，反向差減文庫與正向差減文庫相比，下調(diào)顯著表現(xiàn)在有更多的能量代謝和次級(jí)代謝相關(guān)基因，說明在霜霉病病原菌脅迫下，黃瓜參與次級(jí)代謝和能量代謝基因的表達(dá)更多地受到了抑制或破壞。

劉大軍[18]利用SSH技術(shù)構(gòu)建抗病黃瓜材料接種霜霉病菌和未接種差異表達(dá)的消減cDNA文庫。經(jīng)反向Northern blot雜交檢測(cè)，共得到48個(gè)陽性克隆、14個(gè)UniESTs，包括8個(gè)singletons和6個(gè)contigs，找到了與之匹配的同源序列有10個(gè)EST片段，推測(cè)其余未找到同源序列的EST片段可能是新基因，RT-PCR，試驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量RT-PCR，結(jié)果表明，Csa001907和Csa002921在抗病品種中有可能是黃瓜抗霜霉病的R基因，證明了大部分R基因是組成型表達(dá)的，且在抗病品種中存在下調(diào)表達(dá)現(xiàn)象，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)表明，Csa001907和Csa002921在感病品種中不存在下調(diào)表達(dá)現(xiàn)象。劉大軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜基因組中與擬南芥抗霜霉病基因存在185個(gè)同源R基因，有2個(gè)與甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的R基因，通過聚類分析將這些基因分為6類，初步認(rèn)定Csa001907和Csa002921為黃瓜抗霜霉病的R基因，且在葉片組織中有一定表達(dá)量，其表達(dá)量減少可引發(fā)黃瓜品種的抗病反應(yīng)。

李佩芳[20]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以EF1-α和UBI-ep為內(nèi)標(biāo)基因，探討黃瓜抗霜霉過程與相關(guān)抗性基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗病自交系HNAU-0023防御基因PR-1、MT、PIP、Danj和CAT，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子MAPK1，轉(zhuǎn)錄因子TR、WRKY60、TF和WRKY30相較于感病自交系IL112，表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，表明這些基因在一定時(shí)間段可能參與了黃瓜過敏性抗病反應(yīng)，GNRF可能未參與黃瓜過敏性抗病反應(yīng)，噴施胼胝質(zhì)抑制劑DDG和H2O2抑制劑DPI/DMTU 6 h后接種霜霉病菌，相較于清水對(duì)照，抗病自交系HNAU-0023的防御基因PR-1、PIP和MT，轉(zhuǎn)錄因子TR、TF、WRKY60、WARKY30和MYC，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子RBOH和MAPK1表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，說明抑制劑DPI/DMTU/DDG可有效地抑制前期高效上調(diào)表達(dá)抗性基因下調(diào)表達(dá)，同時(shí)證實(shí)這些抗性基因參與了過敏性抗病反應(yīng)，可能是黃瓜抗霜霉病過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因。

劉大軍等[21]分析了SSH-EST代表的基因功能，發(fā)現(xiàn)葉綠體的重建和保護(hù)機(jī)制和抗氧化脅迫能力與抗病品種抗病能力密切相關(guān)，同時(shí)，提出可能參與了R基因介導(dǎo)的防御反應(yīng)有SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順反異構(gòu)酶，R蛋白的“保衛(wèi)靶”可能是smHSP，負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的異常，該發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于揭示活性氧機(jī)制和R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)機(jī)制之間關(guān)系的關(guān)鍵證據(jù)。李曉輝[22]通過qRT-PCR分析結(jié)果表明，黃瓜抗病品種HNAU-0023離體葉片在接種霜霉病菌48和72 h后CsFBXL基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，而在誘導(dǎo)24 h時(shí)感病自交系112顯著上調(diào)表達(dá)，這暗示CsFBXL基因具有組織特異性表達(dá)的同時(shí)可能對(duì)黃瓜霜霉病過敏性抗病反應(yīng)存在負(fù)調(diào)控，在不同激素(ABA、SA、JA)誘導(dǎo)下，前期表達(dá)量均較弱，CsFBXL基因在24 h時(shí)在ABA、SA誘導(dǎo)下顯著表達(dá)，JA的表達(dá)量次于二者，因此，推測(cè)ABA、SA、JA激素誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控可能有黃瓜泛素CsFBXL基因的參與。

目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用廣泛，定量極微量的基因表達(dá)或DNA拷貝數(shù)通過此技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合成為可能，且熒光定量PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記核酸化學(xué)技術(shù)和寡核苷酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，使定量PCR技術(shù)在臨床疾病的診斷和治療方面可能有幫助。SSH是結(jié)合了抑制性PCR和消減雜交技術(shù)的快捷、有效的差異基因篩選方法，比傳統(tǒng)的DD-PCR、SAGE及cDNA-RNA等技術(shù)假陽性低、低豐度mRNA富集效率高、靈敏度高、重復(fù)性好等，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物發(fā)育與分化、微生物基因分型差異、疾病易感性差異、病理和正常樣本方面的抗藥性差異和組織差異的研究。

6　問題與展望

6.1增加分子標(biāo)記類型，加速優(yōu)良新品種的選育進(jìn)程在抗病基因的分子標(biāo)記方面雖達(dá)到了理想距離，但目前用于黃瓜遺傳與育種研究中的分子標(biāo)記主要是SSR、AFLP和RAPD標(biāo)記，與其他植物相比，獲得的分子標(biāo)記類型相對(duì)較少。為加速黃瓜優(yōu)良新品種的選育進(jìn)程，擴(kuò)展黃瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性和重視黃瓜基因表達(dá)及調(diào)控等方面的研究，克隆主要經(jīng)濟(jì)性狀基因并開發(fā)相關(guān)廉價(jià)快捷的分子標(biāo)記方法非常必要。

6.2培育高抗黃瓜霜霉病品種應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)在黃瓜抗霜霉病基因方面，對(duì)于抗霜霉病相關(guān)基因的功能驗(yàn)證方面相對(duì)復(fù)雜，研究相對(duì)較少，篩選更為精確的黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因、利用其優(yōu)化黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系是黃瓜抗霜霉病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，分離黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因，利用分子育種手段培育高抗黃瓜霜霉病品種，打破效率和成本因素，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，是黃瓜霜霉病分子生物學(xué)研究的實(shí)際目標(biāo)。

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New Progress in Molecular Markers and Related Genes of Cucumber Downy Mildew

ZHANG Zhi, WANG Qi-qi, HE Dong

(College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar university, Qiqihar, Heilongjiang 161006)

Research progress of the molecular biology of cucumber downy mildew was reviewed from the aspects of the characteristics, occurrence regularity, molecular marker, pathogen of cucumber downy mildew, related isolation and identification of downy mildew gene. The direction of future research was forecasted.

Cucumber downy mildew; Gene; Molecular marker; Cloning

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目“鉀對(duì)高寒地區(qū)設(shè)施黃瓜生長影響的研究”(11551538)。

張志(1966- )，男，黑龍江海倫人，副教授，碩士，從事生物遺傳學(xué)方面的研究。

2016-05-26

S 436.421.1+1

A

0517-6611(2016)18-120-03