李春玲， 楊世海

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118)

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水飛薊組織培養(yǎng)的研究進展

李春玲， 楊世海*

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118)

對水飛薊組織培養(yǎng)中外植體來源、愈傷組織誘導、再生植株誘導、毛狀根誘導以及組織培養(yǎng)物中活性成分等方面進行了綜述，以期為解決水飛薊的資源需求以及以組織培養(yǎng)為基礎的基因與代謝工程研究提供理論及技術指導。

水飛薊；組織培養(yǎng)；愈傷組織；毛狀根

水飛薊Silybummarianum(L.)Gaertn.又名水飛雉、奶薊、老鼠筋，為菊科水飛薊屬植物，以其干燥成熟果實入藥[1-2]，原產(chǎn)于南歐、北非，在歐洲作為治療肝膽疾病的民間用藥已有2 000多年歷史[3]。1952年，北京植物園從英國引進做觀賞植物栽培，1972年由中國土產(chǎn)畜產(chǎn)進出口公司天津土產(chǎn)分公司從德國引種作為藥用植物栽培[4]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素具有較強的抗氧化功能，能保護肝臟細胞免受自由基破壞；促進蛋白質的合成，加快制造新的肝臟細胞，或使已受損的肝臟細胞自行修復。因此被稱為“天然的保肝藥”。除具有預防和治療肝膽疾病外，還具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、提高免疫力等功能[5-8]。水飛薊素已被FDA作為營養(yǎng)品和治療攝入肝臟毒性的藥物收錄。除藥用價值外，水飛薊在油料、飼料、蜜源、觀賞及食品保健等方面也有廣泛應用。

水飛薊是近幾十年來國內新發(fā)展的一個藥材品種，目前國內數(shù)十家制藥廠用來提取水飛薊素，主要出口德國、美國、日本，用于制藥和用作食品添加劑，年需求水飛薊原料5萬t左右。國內有些藥廠用以制成治療肝病的藥品如水飛薊素膠囊、水飛薊賓膠囊、水飛薊賓葡甲胺片等[9]。雖然利用微生物和化學方法可以人工合成藥用化合物，但其價格昂貴，有副作用[10]。人們試圖通過多種手段來解決水飛薊資源問題。藥用植物組織培養(yǎng)技術作為中藥生物工程的核心內容之一，在藥用植物的資源保護和可持續(xù)發(fā)展方面具有重要作用。目前，藥用植物細胞的大量培養(yǎng)主要用來生產(chǎn)藥物和次生代謝物質，如抗癌藥物、生物堿等。關于水飛薊生物技術方面，國內外都有研究，但國外研究較多。藥用植物的細胞培養(yǎng)，克服了藥用植物生長緩慢、有效成分積累有限、種植季節(jié)限制等問題。筆者對近20年的水飛薊組織培養(yǎng)研究進行綜述, 以期為水飛薊組織培養(yǎng)研究提供參考和理論指導。

1　無菌苗

研究表明，在對水飛薊進行離體培養(yǎng)時，最常用的外植體材料為水飛薊種子無菌培養(yǎng)后所獲得的無菌苗。水飛薊的種皮上常附有各種微生物, 其種皮內部也會產(chǎn)生內生菌，一旦被帶入培養(yǎng)基，即會迅速繁殖滋生，造成感染，培養(yǎng)失敗，因此，培養(yǎng)前通常需進行消毒處理，以提高其發(fā)芽率，避免污染。無菌苗培養(yǎng)一般是挑選成熟飽滿的水飛薊種子，在超凈工作臺內用溫水浸泡20～60 min后，用無菌水沖洗3次，70%～75%乙醇消毒30～60 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%～0.5%HgCl2浸泡1～7 min，無菌水沖洗5次；或者將30%左右的次氯酸鈉替換HgCl2浸泡20 min。最后用滅菌濾紙將種子表面的水分吸干，接種在MS固體培養(yǎng)基中，置于溫度(26±2)℃、光強強度2 000 lx、光照時間12 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，萌發(fā)水飛薊無菌幼苗。

2　愈傷組織誘導

在誘導水飛薊愈傷組織時，常用水飛薊無菌苗的葉、莖、根部作為外植體材料。生長素和細胞分裂素在水飛薊愈傷組織誘導過程中共同起決定性作用，單一細胞分裂素不能誘導水飛薊產(chǎn)生愈傷組織。因此，多以NAA、6-BA和ZT等激素混合協(xié)同作用，在25 ℃、黑暗條件下誘導愈傷組織的發(fā)生。但不同研究者對以上具體條件的報道有所差異。

傅瑜[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同外植體誘導情況存在明顯差異。將水飛薊的莖、葉、根為外植體材料，接種于MS+NAA 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L和MS+ZT1 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的固體培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。其中，莖的誘導率是100%，葉的誘導率是95%，根的誘導率是60%，莖的愈傷組織為乳白色，半透明，是較好的誘導愈傷的材料，葉黃綠色，表面光滑，是較好的愈傷增殖材料。

姜婷婷[12]研究認為，以B5為基本培養(yǎng)基，根為外植體接種后無明顯的分化跡象，節(jié)部、葉片和節(jié)間在B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT培養(yǎng)基中可以誘導出不同程度的愈傷組織團塊。其中，葉片誘導出的愈傷組織增殖最快。

姜鴻運等[13]對水飛薊愈傷組織懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基種類對水飛薊細胞增長量具有明顯的作用，MS培養(yǎng)基最有利于水飛薊懸浮細胞增長量的大幅增加，其次為B5、N6、White。

Cacho等[14]研究發(fā)現(xiàn)，生長10 d的水飛薊幼苗在pH 5.6的MS+1 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L BA固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30 d誘導出水飛薊愈傷組織。

Rady等[15]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.25 mg/L 2,4-D+0.25 mg/L KT，愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.25 mg/L BA+0.25 mg/L NAA。

Guinea等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下在MS+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT固體培養(yǎng)基中能獲得質地疏松的愈傷組織，也是建立細胞懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。Bekheet等[17]以葉片、葉柄和莖段作為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加5 mg/L KT+0.5 mg/L IAA誘導愈傷組織，以葉片為外植體誘導率最高。研究還發(fā)現(xiàn)，在5 mg/L KT+ 0.5 mg/L IAA + 0.1 mg/L GA3培養(yǎng)基中培養(yǎng)的愈傷組織能得到最大的生長量。Becker等[18]研究發(fā)現(xiàn)，用NAA和KT組合也能誘導出愈傷組織，但這些愈傷組織的存活時間不超過90 d。

在節(jié)部和節(jié)間外植體愈傷組織的誘導過程中，愈傷組織形成速度較慢，21～28 d后所形成的團塊也較小。經(jīng)繼代培養(yǎng)后，生長速度明顯加快。3種誘導愈傷組織培養(yǎng)基的誘導率由高到低依次為1/2MS、MS、改良white，節(jié)部外植體愈傷組織的誘導率高于節(jié)間外植體。ZT對 NAA與BA的綜合效果可能有一定的促進作用[19]。

研究表明，水飛薊根組織的分化程度較高，葉和莖組織分化程度較低，最易脫分化，產(chǎn)生愈傷組織。在誘導愈傷組織的試驗中，水飛薊葉和莖是較為理想的材料，根組織分化程度較高，脫分化產(chǎn)生愈傷組織困難。這說明誘導水飛薊愈傷組織常用的基本培養(yǎng)基為MS。

3　毛狀根誘導

1900年，Stewart等[20]第一次提出“毛狀根(hairy root)”的概念。1977年，Ackermann[21]首先成功地用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染高等植物獲得毛狀根。直到20世紀80年代，毛狀根培養(yǎng)體系作為基因工程和細胞工程相結合的一項技術受到越來越多的關注。目前，已有近百種藥用植物成功誘導出毛狀根，其中，大部分為草本植物，也有少量木本及藤本植物。水飛薊毛狀根培養(yǎng)體系國外研究最早，文獻報道也最多。

Rahnama等[22]和Kim等[23]以胚軸、幼苗葉和子葉為外植體，在pH 5.8的MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d。預培養(yǎng)后的外植體浸入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液侵染10 min，然后用無菌濾紙擦干，共培養(yǎng)3 d后，轉移至含有250 mg/L頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)28～35 d，產(chǎn)生水飛薊毛狀根。另一種方法是在整個苗期使用胰島素注射器將發(fā)根農(nóng)桿菌菌液注射在下胚軸。毛狀根主要從外植體的切割面出現(xiàn)，長至4～5 cm后進行分離，在黑暗中以無激素的MS液體培養(yǎng)基為繼代培養(yǎng)基，在25 ℃、搖床轉速130 r/min黑暗條件下，每14 d繼代一次。

Bekheet等[17]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染水飛薊子葉10 min，在28 ℃黑暗條件下，搖床轉速為100 r/min的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)21～28 d，獲得大量水飛薊毛狀根。研究表明，不同年齡段的外植體均表現(xiàn)出不同比例的毛狀根誘導轉化率，用新鮮的水飛薊葉片為外植體誘導毛狀根轉化率更高。

Rahnama等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用發(fā)根農(nóng)桿菌AR15834接種水飛薊下胚軸、子葉和葉片，接種7～10 d后，在外植體受傷的部位誘導出水飛薊毛狀根。其中，150個子葉外植體接種，28 d后經(jīng)β-葡萄糖醛酸染色鑒定有45(30%)個水飛薊毛狀根成功誘導。水飛薊下胚軸誘導率為7.9%，子葉為21.6%，采用注射的方法對整株水飛薊植物體的誘導率為20%。

張淑麗[24]采用R15834、R1601、R1000、1025、A4、R1 6種發(fā)根農(nóng)桿菌對水飛薊的根、葉片、莖段3種外植體進行誘導，結果6種發(fā)根農(nóng)桿菌都能夠侵染并產(chǎn)生毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌A4、1601、15834、R1和1025誘導率具有顯著性差異(P<0.05)，其中，A4誘導率最高(84.83%)。莖段只有A4、1601、15834 3種發(fā)根農(nóng)桿菌誘導產(chǎn)生毛狀根，其中，1601的誘導率最高(20.00%)。葉片只有A4、1025和R1 3種發(fā)根農(nóng)桿菌能夠誘導毛狀根，其中，A4誘導率最高(29.00%)。6種發(fā)根農(nóng)桿菌中，A4菌株能夠成功誘導水飛薊根段、莖段、葉片3部分產(chǎn)生毛狀根，其中，根段誘導產(chǎn)生的毛狀根誘導率高，分枝多，證實A4發(fā)根農(nóng)桿菌侵染水飛薊根段產(chǎn)生毛狀根為最佳方法。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌對水飛薊的下胚軸、子葉、葉片、莖段、根進行毛狀根的誘導，均能獲得毛狀根。國內外研究表明，大多以發(fā)根農(nóng)桿菌AR15834和A4為誘導水飛薊毛狀根所用菌液。水飛薊毛狀根無論是預培養(yǎng)、共培養(yǎng)還是繼代培養(yǎng)幾乎均采用MS為基本培養(yǎng)基。

4　再生植株

植物體外形態(tài)受到多種因素的影響，如外植體初始類型、生長調節(jié)劑、培養(yǎng)條件、基因型與營養(yǎng)成分。導致整個植物體細胞胚胎發(fā)生、芽的形成及根的產(chǎn)生即獲得再生植株的途徑主要有2個：直接產(chǎn)生植物再生器官過程，沒有形成愈傷組織的中間階段；間接培養(yǎng)成愈傷組織，再分化成再生植株。而調節(jié)生長素和細胞分裂素之間的配比是形成不定芽和不定根最主要的方法。

Pierik[25]研究表明，6-BA對獲得水飛薊直接再生器官有很強的作用，KT和NAA配合使用能更有效地獲得愈傷組織，進而形成再生植株。MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA能獲得水飛薊不定芽，2 mg/L KT+2 mg/L NAA配比可以更好地獲得愈傷組織。Abbasi等[26]研究表明，將同種外植體轉移至MS+2.0 mg/L GA3+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中，30 d后獲得較多數(shù)量的再生芽組織器官。John等[27]研究表明，在添加2 mg/L NAA+1.5 mg/L BA的培養(yǎng)基上，水飛薊愈傷組織全部轉化成不定芽。

劉四清等[28]將1 cm長的無菌苗下胚軸置于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+水解酪蛋白200 mg/L的固體培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，隨后轉移至MS+0.8 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上，分化出不定芽后將芽從愈傷組織表面切下移入MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+200 mg/L水解酪蛋白的固體培養(yǎng)基上誘導生根。得到的完整植株用自來水沖洗除去瓊脂，并浸泡1 d，移栽至土壤中。

姜婷婷[12]研究發(fā)現(xiàn)，誘導不定芽最適培養(yǎng)基組合為B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，而誘導培養(yǎng)不定根的最適培養(yǎng)基為B5+1.0 mg/L NAA。

Bekheet等[17]研究表明，以葉片為外植體直接獲得再生芽器官的最佳培養(yǎng)基為1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA，相同的外植體在2 mg/L KT+2 mg/L NAA的培養(yǎng)基上間接形成芽器官。為了進一步研究器官形成和試管苗增殖的能力，以葉片為外植體在MS培養(yǎng)基中添加6-BA、KT、NAA不同組合的培養(yǎng)基，經(jīng)過35 d的培養(yǎng)，獲得直接(芽)和間接(愈傷組織)再生器官組織。結果發(fā)現(xiàn)，直接和間接芽器官的形成主要取決于培養(yǎng)基中加入生長調節(jié)劑。培養(yǎng)基中含有NAA和6-BA更適合直接芽的形成。然而，KT和NAA組合是形成間接器官最合適的激素種類。在此培養(yǎng)基中愈傷組織培養(yǎng)35 d后變成綠色，顯示出器官親葉和莖形態(tài)，在1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA的培養(yǎng)基中直接器官發(fā)生的比例高達60%。在添加2 mg/L KT+2 mg/L NAA培養(yǎng)基中有50%間接器官形成。

水飛薊再生植株我國研究較早，但文獻報道較少，只有在20世紀90年代有一些研究，且研究內容不包括再生植株的水飛薊素含量測定。水飛薊愈傷組織誘導及再生植株分化培養(yǎng)基多以MS為基本培養(yǎng)基，也有少部分用B5培養(yǎng)基。

5　有效成分

Cacho等[14]對水飛薊體外培養(yǎng)體系研究發(fā)現(xiàn)，細胞懸浮培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng)中水飛薊素積累量高于植物子葉中水飛薊素的含量。Alikaridis等[29]對水飛薊毛狀根與未轉化的植物根部進行檢測和鑒定，發(fā)現(xiàn)未轉化的根部含有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧；水飛薊毛狀根中含有異水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧。

Iqbal等[30]以葉、莖尖、莖段為外植體獲得水飛薊再生幼苗，經(jīng)測定再生植株中水飛薊賓的含量高于原植物。將試管苗移栽至土壤中，隨著栽培時間和培養(yǎng)基成分的不同，水飛薊賓的產(chǎn)量也隨之變化。培養(yǎng)56 d后水飛薊賓達最高積累量。

Rahnama等[22]建立水飛薊毛狀根培養(yǎng)的8種體系并測定了水飛薊素各個黃酮類化合物的積累量，與未轉化的根進行比較后發(fā)現(xiàn)，水飛薊毛狀根產(chǎn)生的水飛薊賓含量為0.007 mg/g DW、異水飛薊賓為0.011 mg/g DW、水飛薊亭為0.041 mg/g DW、水飛薊寧為0.042 mg/g DW和花旗松素為0.009 mg/g DW。這均明顯高于水飛薊根部含量。其中，水飛薊素最高產(chǎn)量為1.000 mg/g DW。

Rady等[15]對不同基因型水飛薊愈傷組織中水飛薊素含量進行測定，結果表明，水飛薊愈傷組織中水飛薊亭含量在0.09～2.01 mg/g，水飛薊寧為0.02～0.25 mg/g，水飛薊賓為0.01～0.61 mg/g，總水飛薊素最高積累量達2.1 mg/g。

Alikaridis等[29]對生長28 d的水飛薊植物注射發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生的毛狀根與相同生長齡的水飛薊植物根部黃酮類化合物進行比較，發(fā)現(xiàn)水飛薊植物根部主要含有的黃酮類化合物為水飛薊賓17.9%和水飛薊亭8.1%，水飛薊誘導的毛狀根中含量最多的黃酮類化合物為異水飛薊賓17.7%。

Alikaridis等[29]研究結果與其他研究者有所差異，這可能是由于用HPLC洗脫時間不同有關，洗脫時間減少有可能導致單峰合并，所以水飛薊毛狀根中黃酮類化合物只檢測到異水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧。

6　結語與展望

該研究對水飛薊的組織培養(yǎng)進行了歸納和總結，對水飛薊組織培養(yǎng)過程中外植體來源及預處理、愈傷組織誘導、再生植株誘導、毛狀根誘導以及組織培養(yǎng)產(chǎn)物中活性成分4個方面進行了總結與分析。隨著水飛薊組織培養(yǎng)的發(fā)展，以望通過懸浮細胞培養(yǎng)或者毛狀根培養(yǎng)來直接生產(chǎn)水飛薊賓、水飛薊素黃酮等活性化合物；培養(yǎng)再生植株，與大田栽培相結合，旨在培育出單位面積產(chǎn)量更高的水飛薊品種。

目前，水飛薊組織培養(yǎng)過程中仍存在許多問題，如水飛薊毛狀根和愈傷組織中生產(chǎn)的黃酮類化合物比水飛薊種子中的含量低，需要尋求一種新的方法來提高毛狀根中黃酮木脂素類化合物的生產(chǎn)水平。但隨著水飛薊組織培養(yǎng)的深入研究，以期這些問題能得到解決，為以后其他研究的開展奠定基礎。

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Research Progress of Tissue Culture ofSilybummarianum(L.) Gaertn.

LI Chun-ling, YANG Shi-hai*

(College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118)

We summarized the explant source, callus induction, regeneration induction, hairy roots induction and active components in tissue culture ofSilybummarianum(L.) Gaertn.This research aimed to provide theoretical and technical guidance for the resource demand ofS.marianumand the genetic and metabolic engineering research based on tissue culture.

Silybummarianum(L).Gaertn.; Tissue culture; Callus; Hairy roots

吉林省科技發(fā)展計劃重大項目 (20126046)。

李春玲(1990- )，女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：中藥學。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事中藥生物技術方面的研究。

2016-05-07

S 503.53

A

0517-6611(2016)17-187-03