黃 娟，徐 文，譚瑞湘，白俊其，李西文，黃志海＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

基于DNA條形碼的嶺南特色藥材廣東海桐皮、木棉花與其混淆品的分子鑒定＊

黃 娟1，徐 文1，譚瑞湘1，白俊其1，李西文2，黃志海1＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：本研究主要應(yīng)用第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）序列作為DNA條形碼進(jìn)行分析，建立對(duì)嶺南中藥廣東海桐皮、木棉花與其混淆品的快速鑒定法。方法：收集廣東海桐皮等9個(gè)物種樣本，提取樣本基因組DNA，擴(kuò)增ITS2基因片段，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列采用CodonCode Aligner進(jìn)行拼接。利用MEGA 6.06軟件進(jìn)行種間變異及遺傳距離分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果：9個(gè)物種的ITS2序列長(zhǎng)度范圍為224-237 bp，物種的種內(nèi)遺傳距離（0.000-0.017）明顯小于種間遺傳距離（0.045-0.820），NJ和ML聚類樹顯示，各物種樣本獨(dú)聚一支，表現(xiàn)出單系性。結(jié)論：ITS2序列能夠有效鑒別植物海桐皮、木棉花與其混淆品，為其基原植物鑒定提供依據(jù)，為保證用藥真實(shí)及其臨床療效提供分子鑒定方法。

海桐皮 木棉花 ITS2序列 分子鑒定 DNA條形碼

中藥材的真?zhèn)问侵兴庂|(zhì)量控制的首要問(wèn)題。嶺南藥材為廣東特色中藥材，其中部分道地藥材已被《中國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《藥典》）收錄，如：廣金錢草、廣藿香、化橘紅、何首烏、陳皮、佛手等；但大部分廣東常用中藥材尚未被《藥典》收載，且與《藥典》收載的品種同名，如：絡(luò)石藤與廣東絡(luò)石藤、旋覆花與廣東旋覆花、海風(fēng)藤與廣東海風(fēng)藤、合歡花與廣東合歡花、海桐皮與廣東海桐皮等。上述同名異物藥材在臨床上常?；煊?，嚴(yán)重影響臨床療效。

木棉科植物木棉Bombax malabaricum具有重要的藥用價(jià)值，其樹皮、花分別以廣海桐皮、木棉花之名收載于現(xiàn)行《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中[1]。廣東海桐皮，原載于《生草藥性備要》中，在廣東歷來(lái)作為海桐皮使用，有清熱利濕、活血、消腫的功效，為與其它地區(qū)習(xí)用海桐皮區(qū)別，故以廣東海桐皮命名。據(jù)調(diào)查，全國(guó)稱之為海桐皮的植物種類來(lái)源多，其正品為豆科刺桐Erythrina variegate Linn.樹皮，習(xí)用品刺楸Kalopanax septemlobus有川桐皮之稱，椿葉花椒Zanthoxylum ailanthoides在福建及江浙地區(qū)也作為海桐皮使用[2]。同名藥材來(lái)源的多樣性容易混淆使用并使得臨床療效不確定。因此，對(duì)海桐皮快速、準(zhǔn)確的鑒定并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其臨床用藥安全有效具有重要的指導(dǎo)意義。

DNA條形碼鑒定技術(shù)是基于遺傳信息的鑒定方法，具有鑒定準(zhǔn)確快速、不受研究對(duì)象外部形態(tài)干擾等特點(diǎn)，特別適合中藥材的鑒定[3]。其中ITS2條形碼在中草藥的鑒定應(yīng)用非常廣泛，如：應(yīng)用ITS2開展赤芍、鎖陽(yáng)、山豆根等中藥及其混淆品的鑒定研究已取得一定成果[4-6]。為保證臨床用藥的安全性和有效性，本文基于ITS2條形碼技術(shù)開展嶺南特色藥材廣東海桐皮、木棉花與其常見混淆品的鑒定研究，為建立快速、準(zhǔn)確的鑒定方法和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 藥材

本研究共收集海桐皮E. variegata Linn.、木棉花B. malabaricum DC.及其混淆品美麗異木棉Ceiba speciosa、吉貝C. pentandra L. Gaetn.、刺楸K. septemlobus Thunb. Koidz.、椿葉花椒Z. ailanthoides Sieb. Et. Zucc.、簕欓花椒Z. avicennae Lam. DC.、大葉臭花椒Z. myriacanthum Wall. Ex Hook. f.、楤木Aralia chinensis L. 9個(gè)物種16個(gè)樣本。植物材料由華南植物鑒定中心葉華谷研究員鑒定，憑證標(biāo)本已分別保存于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院和中科院華南植物鑒定中心。同時(shí)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲3條完整的ITS2序列，驗(yàn)證后用于比較分析。具體信息見表1。

1.2 試劑和儀器

植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：P4104）；D2000 DNA Marker（日本TaKaRa 公司，批號(hào)：P4219）；2×Taq PCR Mix 酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)：262451AX）；無(wú)水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150604）；異丙醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150309）；Tris（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900483）；β-巰基乙醇（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：M6250）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：T818979）；Glodview核酸染料（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：20151209）；瓊脂（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900500）。引物由上海美吉生物科技有限公司合成。

ProFlex PCR system（美國(guó)Life Technologies公司，型號(hào)：ProFlex）；小型離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司，型號(hào)：5418）；多功能樣品均質(zhì)器（法國(guó)Bertin Technologies公司，型號(hào)：Precellys 24孔）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：GelDoc XR+）；多功能垂直旋轉(zhuǎn)混合器（英國(guó)Grant公司，型號(hào)：PTR-30/PTR-60）；水平電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-Sub Cell GT）。

1.3 方法

取根莖40 mg或葉片30 mg左右于2 mL離心管中，加入鋼珠磨碎樣品，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取植物基因組總DNA。通過(guò)ITS2片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物：ITS2F：5’-ATGCGAT ACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物：ITS3R：5’-GACG CTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括正、反向引物各1 μL（2.5 μmol·L-1），2×Taq PCR Mix酶 12.5 μL，模板DNA 2.0 μL（約30-100 ng），加TE緩沖液補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40個(gè)循環(huán)）；72 ℃、10 min[10]。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列[6]。利用軟件MEGA 6.06進(jìn)行分析比對(duì)，分析變異位點(diǎn)，基于K2P模型進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹及ML樹[8,9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS2序列分析

9種海桐皮、木棉花及混淆品ITS2序列長(zhǎng)度均較短，在224- 237 bp之間。其中，木棉花序列長(zhǎng)度為237 bp，無(wú)種內(nèi)變異位點(diǎn)；刺楸比對(duì)后序列長(zhǎng)度為230 bp，有2個(gè)變異位點(diǎn)，為100位點(diǎn)C/T突變、217位點(diǎn)A/G突變；簕欓花椒序列長(zhǎng)度均為224 bp，有1個(gè)變異位點(diǎn)，為132位C/T突變，大葉臭花椒序列長(zhǎng)度為224 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。應(yīng)用MEGA 6.06分析所得的16條完整的ITS2序列，發(fā)現(xiàn)不同物種間的ITS2序列變異較大。木棉與異木棉屬美麗異木棉及吉貝間均有20多個(gè)變異位點(diǎn)，可明顯區(qū)分。海桐皮與其混淆品之間也具有較多變異位點(diǎn)，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，正品海桐皮與其偽品木棉、刺楸、椿葉花椒、簕欓花椒、大葉臭花椒、楤木間分別有96、108、98、97、100、及103個(gè)變異位點(diǎn)。詳見表2。

表1 海桐皮、木棉花與其混淆品樣本信息

表2 海桐皮、木棉花與其混淆品的ITS2序列特征

2.2 遺傳距離分析

基于MEGA 6.06分析得到種間K2P距離（表3）。分析發(fā)現(xiàn)，同屬植物美麗異木棉與吉貝間種間K2P距離最小，與植物分類學(xué)一致。物種間K2P距離（0.045-0.820）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離（0.000-0.017），可將各物種明顯區(qū)分。

2.3 聚類樹分析

為確定ITS2序列在海桐皮、木棉花與其混淆品之間的鑒定能力，本實(shí)驗(yàn)基于K2P模型構(gòu)建了兩種不同的聚類樹，即NJ樹和ML樹，并去除bootstrap支持率小于50%的分支，見圖1和圖2。分析NJ樹結(jié)果，海桐皮基原植物單獨(dú)成枝，木棉屬植物木棉、美麗異木棉及吉貝聚成一大支，椿葉花椒、簕欓花椒及大葉臭花椒聚成一支；ML樹結(jié)果顯示，除了美麗異木棉、吉貝與木棉分開單獨(dú)成枝，其余分支情況與NJ樹一致。兩個(gè)聚類樹結(jié)果共同表明，各物種種內(nèi)樣本分別聚在一支，表現(xiàn)出單系性，與其他品種能夠明顯區(qū)分。

3 討論

本文對(duì)海桐皮、其習(xí)用品及相關(guān)同屬植物進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，同屬植物美麗異木棉與吉貝間種間K2P距離最小，僅為0.045；但兩者間存在9個(gè)變異位點(diǎn)，且聚類樹結(jié)果bootstrap支持率均大于90%，因此易于區(qū)分。分析其他物種，發(fā)現(xiàn)其余各品種間的變異位點(diǎn)數(shù)量均大于20個(gè)，且遺傳距離距離較大（0.111-0.820），可明顯區(qū)分。聚類樹結(jié)果顯示，同屬植物聚為一大支，符合生物學(xué)分類特點(diǎn)；且各物種獨(dú)聚一支，表現(xiàn)出單系性。以上結(jié)果證明，利用ITS2序列可準(zhǔn)確鑒定海桐皮、木棉花及相關(guān)混淆品，迅速判斷基原植物，給臨床使用提供一定的參考價(jià)值。

中藥材因歷史淵源、民間習(xí)俗等原因，長(zhǎng)期存在異藥同名的現(xiàn)象，甚至地方標(biāo)準(zhǔn)和《中國(guó)藥典》中也存在嚴(yán)重的同名異物問(wèn)題[10]，加之中藥材市場(chǎng)的混亂，造成中藥材品種難以區(qū)別的現(xiàn)象。南藥海桐皮為同名異藥的典型，各地均有該名稱藥材，而基原植物品種相差甚遠(yuǎn)。無(wú)論是廣海桐皮還是川桐皮均以樹皮入藥，難以從外觀上準(zhǔn)確鑒定，尤其是對(duì)于非植物鑒定專業(yè)人員。因此，本文從分子鑒定方法入手，建立了一種快速鑒定海桐皮基原植物的方法。由于樣本采集條件的限制，本文所采集植物樣本基本分布在廣東地區(qū)，具有一定的代表性，但并不能囊括該植物的全部特點(diǎn)。由于遺傳背景的差異，可能造成不同地區(qū)DNA條形碼序列的變化。在后期研究中，將擴(kuò)大采集樣本地區(qū)，綜合分析各物種不同地區(qū)之間的差異，為全面準(zhǔn)確鑒定植物提供依據(jù)。

針對(duì)中藥材市場(chǎng)混亂的現(xiàn)象，本文認(rèn)為對(duì)于中藥飲片應(yīng)在出廠前進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，結(jié)合外觀、顯微等傳統(tǒng)鑒定方法及分子鑒定手段確認(rèn)藥材基原植物。同時(shí)可以利用二維碼技術(shù)構(gòu)建植物特別是藥材DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，明確基原、產(chǎn)地、功效等信息，達(dá)到中藥材市場(chǎng)信息化、準(zhǔn)確化、便利化的目的，利于臨床醫(yī)生療效判斷，也為患者提供參考。

圖1 基于ITS2序列的南藥材海桐皮、木棉花與其混淆品NJ樹

圖2 基于ITS2序列的南藥材海桐皮、木棉花與其混淆品ML樹

1 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第二冊(cè)).廣州:廣東科技出版社, 2011: 43.

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5 侯典云,宋經(jīng)元,石林春,等.中藥材鎖陽(yáng)的ITS2條形碼分子鑒定研究.中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(23): 4028-4032.

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Molecular Identification of Erythrina variegate Linn., Bombax malabaricum and Their Adulterants Using DNA Barcode

Huang Juan1, Xu Wen1, Tan Ruixiang1, Bai Junqi1, Li Xiwen2, Huang Zhihai1
(1. The 2ndClinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Institute of Chinese Material Medica, China Academy of Chinese Medicines, Beijing 100700, China)

A molecular identification method taken ITS2 as DNA barcode was adopted to distinguish E. variegate, B. malabaricum from their adulterants. Samples from nine species were gleaned. The ITS2 regions were amplified with bi-directional sequencing. Along with some downloaded ones from the GenBank database, all sequences were assembled by CodonCode Aligner and analyzed by MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were computed and phylogenetic tree was built using the neighbor-joining (NJ) and maximum likelihood (ML) trees. As a result, it was found that the lengths of ITS2 sequence of the nine species varied from 224 to 237 bp. The intraspectific distance (0.000-0.017) was significantly shorter than the interspecific distance (0.045-0.820). The results of NJ tree and ML tree presented that all the nine species were separately and obviously clustered to one branch, a monophyletic clade. In conclusion, the ITS2 sequence can be treated as an ideal DNA barcode for the molecular identification of E. variegate, B. malabaricum and their adulterants, providing a reference for clinical application.

Erythrina variegate, Bombax malabaricum, ITS2, molecular identification, DNA barcode

10.11842/wst.2016.08.027

R282

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-07-28

修回日期：2016-08-10

＊ 廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項(xiàng) (2015KT1817)：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：黃志海，主任藥師，主要研究方向：中藥資源與中藥鑒定研究。