黃輝慶，黃志海，黃 娟，張 靖，張曉檸，丘小惠＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 廣州 510006；2. 國家人類基因組北方研究中心/北京諾賽基因組研究中心有限公司/基因組學研究北京市重點實驗室 北京 100176）

應(yīng)用ITS2條形碼鑒定嶺南藥材余甘子及其混淆中藥品種＊

黃輝慶1，黃志海1，黃 娟1，張 靖1，張曉檸2＊＊，丘小惠1＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 廣州 510006；2. 國家人類基因組北方研究中心/北京諾賽基因組研究中心有限公司/基因組學研究北京市重點實驗室 北京 100176）

目的：本研究應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼，建立余甘子及其混淆品分子鑒定方法。方法：收集8種共17份余甘子及其混淆品植物樣本，提取基因組DNA，擴增ITS2基因并雙向測序。所得序列采用Codon Code Aligner進行拼接，同時，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲3條相關(guān)ITS2序列用于比較分析。利用MEGA 6.06軟件分析其種內(nèi)及種間遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果：余甘子ITS2序列長度為208 bp，與其他各物種種間變異位點較多，遺傳距離較大，為0.174-0.823。聚類樹結(jié)果顯示，余甘子基原植物獨聚一支，與其他混淆品能夠容易區(qū)分。結(jié)論：本研究采用ITS2序列能夠有效鑒別余甘子及其混淆品基原植物，可為保證臨床用藥真實安全提供技術(shù)支撐。

余甘子 ITS2序列 分子鑒定 DNA條形碼

大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica Linn.具有重要的藥用價值，其果實為中藥余甘子，收錄于2015版《中國藥典》一部，藥食兼用，具清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效。余甘子樹皮以“紫荊皮”之名收錄于《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008版等地方標準，部分研究者認為其為紫荊皮的正品[1,2]。然而，由于歷史和地區(qū)習俗等多種原因，歷代草本和各地方標準對紫荊皮的基原植物記載均不相同，存在嚴重的“一名多藥”現(xiàn)象，給監(jiān)管帶來難題，如：《全國中藥炮制規(guī)范》收載的紫荊皮來源為豆科植物紫荊Cercis chinensis Bunge，《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》2008版收載紫金皮的來源為木蘭科植物南五味子Kadsura longipedunculata的干燥根皮，兩者常難以分辨[3]。此外，還有衛(wèi)矛科植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum Hutch（《滇南本草》）的根皮、桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus的干燥樹皮等多種植物來源[4]。

DNA條形碼鑒定技術(shù)基于遺傳信息的鑒定方法，具有鑒定準確快速、不受研究對象外部形態(tài)干擾等特點，尤其適合以部位入藥中藥材的真?zhèn)舞b定[5]。其中ITS2條形碼在中草藥鑒定應(yīng)用中非常廣泛，Chen等[6]對753個屬4 800個種內(nèi)的6 600個藥用植物樣本進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2在物種水平的鑒定效率達到92.7%，故推薦其作為藥用植物的標準條形碼。Luo等[7]以蕓香科72屬192種300個樣本為研究對象，通過候選條形碼（matK、rbcL、psbA-trnH、rpoC1、ycf5、ITS2、ITS）的對比篩選研究，發(fā)現(xiàn)ITS2條形碼在所考察的序列中具有最高的物種鑒定成功率?；谇捌谘芯?，本文將探討應(yīng)用ITS2條形碼技術(shù)鑒別余甘子及其同屬藥用植物及紫荊皮混偽品的DNA鑒定方法，為保證紫荊皮、余甘子等中藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥材

本研究共收集余甘子P. emblica及其市場常見混淆品紫荊C .chinensis、南五味子K. longipedunculata、昆明山海棠T. hypoglaucum、紫薇Lagerstroemia indica L.、葉下珠Phyllanthus urinaria L.、小果葉下珠Phyllanthus reticulatus Poir. 9個物種共20個樣本。其中17個樣本為實地采集，材料由廣東省中醫(yī)院黃志海主任藥師鑒定，憑證標本已保存于廣東省中醫(yī)院。此外，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲3條完整的ITS2序列，驗證后用于比較分析。具體信息見表1。

1.2 試劑和儀器

植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：P4104）；2×Taq PCR Mix 酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號：262451AX）；D2000 DNA Marker（日本TaKaRa 公司，批號：P4219）；Glodview核酸染料（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號：20151209）；β-巰基乙醇（美國sigma公司，批號：M6250）；Tris（美國sigma公司，批號：V900483）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號：T818979）；瓊脂（美國sigma公司，批號：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，其余試劑均為分析純。

PCR system（美國Life Technologies公司，型號：ProFlex）；水平電泳槽（美國Bio-Rad公司，型號：Mini-Sub Cell GT）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：GelDoc XR+）；小型離心機（德國eppendorf公司，型號：5418）；多功能樣品均質(zhì)器（法國Bertin Technologies，型號：Precellys 24）；多功能垂直旋轉(zhuǎn)混合器（英國Grant公司，型號：PTR-30/PTR-60）。

表1 余甘子及其混淆品的樣本信息

1.3 方法

選取低溫干燥的植物葉片30 mg或根皮40 mg左右，磨碎后采用天根植物基因組提取試劑盒提取基因組DNA，方法依照說明書。PCR擴增選用通用引物，ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含：上下游引物各1 μL（2.5 μmol·L-1）、2×Taq PCR Mix酶12.5 μL、總DNA 2.0 μL、dd H2O 8.5 μL。擴增程序：94℃、5 min；94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；72℃、10 min[12]。PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將電泳條帶明亮、單一、清晰的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物有限公司廣州辦事處完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得峰圖利用CodonCode Alinger 6.02軟件進行校對拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除5.8S和28S區(qū)段，獲得ITS2序列[8]。將所得序列采用軟件MEGA 6.06進行分析比對，基于K2P模型進行種內(nèi)種間遺傳距離分析，并用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）及最大似然法（Maximum Likehihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹及ML樹[9,10]，同時以bootstrap支持率1 000次重復檢驗各分支的支持率。

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列變異分析

余甘子序列長度均為208 bp，比對后發(fā)現(xiàn)種內(nèi)無變異位點，GC含量為54%。將余甘子與其混偽品紫荊、南五味子、昆明山海棠及紫薇比對后發(fā)現(xiàn)，不同品種間存在較多變異位點，分別為80、90、80及85個變異位點；同時該物種與其同屬植物蜜甘草、浙江葉下珠、葉下珠及小果葉下珠之間也存在明顯差異，分別有60、63、36及42個變異位點。其余物種種內(nèi)比對后發(fā)現(xiàn)：南五味子序列長度為231 bp，有2個變異位點，分別為99、177位T/C突變；昆明山海棠序列長度均為230 bp，種內(nèi)存在1個變異位點，為80位C/T突變；小果葉下珠序列長度為208 bp，種內(nèi)均存在2個變異位點，分別為35位A/C 突變、144位C/G突變；葉下珠種內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)變異位點。由此可見，余甘子及其混淆品種間變異位點明顯多于種內(nèi)變異位點，能夠較好地區(qū)分。

表2 余甘子及其混淆品種間遺傳距離

2.2 遺傳距離分析

基于K2P模型分析得到各物種種內(nèi)及種間遺傳距離。結(jié)果顯示，余甘子種內(nèi)遺傳距離為0，其余物種種內(nèi)遺傳距離均不超過0.013。種間遺傳距離較大，余甘子與其混淆品之間種間距離在0.174-0.823之間，具體各物種間K2P距離見表2。

2.3 聚類樹分析

為確定ITS2序列在余甘子與其混淆品之間的鑒定能力，本研究采用鄰接法及最大似然法分別構(gòu)建NJ樹和ML樹，同時去除bootstrap支持率小于50%的分支，聚類樹見圖1和圖2。分析顯示，兩種聚類樹結(jié)果基本一致。余甘子與葉下珠親緣關(guān)系最近，但兩者之間NJ樹支持率為84.0%，ML樹支持率為65.0%，可將兩者進行很好的區(qū)分。同屬植物余甘子、葉下珠、蜜甘草、浙江葉下珠及小果葉下珠聚為一大支，符合植物分類學特點。同時，各物種種內(nèi)樣本分別聚在一支，表現(xiàn)出單系性，與其他品種能夠明顯區(qū)分。

圖1 基于ITS2序列的余甘子與其混淆品NJ樹

圖2 基于ITS2序列的余甘子與其混淆品ML樹

3 討論

根據(jù)調(diào)研，多數(shù)人認為正品紫荊皮來源為大戟科植物余甘子的干燥樹皮[2]，為骨傷科和婦科常用藥材，具有消腫解毒、收斂止血、殺菌祛腐的作用；用于癰腫、陰囊濕疹、外傷出血、跌打損傷、蛇蟲咬傷。臨床使用的紫荊皮偽品主要來源于豆科植物紫荊的干燥樹皮及木蘭科植物南五味子的干燥樹皮。由于“紫荊皮”未被《中國藥典》收錄，該藥材品種混亂，甚至在研究文獻中來源也不盡相同[11-13]。由于3種植物來源于不同種屬，藥理作用及化學成分存在一定的差異[4,11]，在臨床上不宜混用。由于地方習俗和標準記載不一致，各地使用的紫荊皮來源于不同基原植物，容易引起用藥混亂，導致臨床療效不確切。

傳統(tǒng)鑒別專業(yè)性強，尤其是一些外觀形態(tài)較為相似或深加工飲片，通常無法進行快速鑒定。本實驗基于ITS2序列建立了一種快速鑒定余甘子及其他紫荊皮基原植物的方法。分析發(fā)現(xiàn)，余甘子及其混淆品種內(nèi)變異位點較少（為0-2個），而種間均有幾十個變異位點，且物種內(nèi)最大遺傳距離（0.013）遠小于種間最小遺傳距離（0.173），存在明顯的條形碼間隔；NJ及ML進化樹圖結(jié)果顯示，各物種單獨成支。以上結(jié)果均說明，利用ITS2片段可迅速將余甘子及其混淆品區(qū)分開來。同時，結(jié)果顯示，物種ITS2序列非常穩(wěn)定，如余甘子長度均為208 bp、紫荊長度為216 bp、南五味子序列長度為231 bp，昆明山海棠長度為230 bp，表明ITS2序列適用于余甘子與其混淆品的鑒定。

本研究首次將臨床常用紫荊皮的3種基原植物進行ITS2序列分析，說明采用分子鑒定技術(shù)易將這3種混用品區(qū)分開來。筆者認為，針對現(xiàn)在市場及臨床使用紫荊皮藥材混亂現(xiàn)象，監(jiān)管部門應(yīng)制定統(tǒng)一標準，規(guī)范該藥的來源，同時更正其它以紫荊為皮名的藥材。結(jié)合傳統(tǒng)鑒定技術(shù)及DNA分子鑒定手段，從源頭保證藥材來源的準確性，杜絕臨床同名異藥現(xiàn)象。

1 高婷,朱珣之,宋經(jīng)元.有毒中藥土荊皮的ITS2條形碼序列分析鑒定.世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(3): 387-392.

2 崔國靜,石思佳,宋桂英.紫荊皮與混亂品的鑒別.首都醫(yī)藥, 2010, 23: 43.

3 周勝建,祝慶明.紫荊皮的本草學考辨.時珍國醫(yī)國藥, 2005, 16(3): 265-266.

4 程小麗,廖彩麗,劉春生,等.基于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫的紫荊皮混淆品種華中五味子的DNA鑒定研究.中國中藥雜志, 2012, 37(17): 2534-2537.

5 費希同,巨苗苗,林源,等. ITS2序列在植物DNA條形碼鑒定中的應(yīng)用.亞熱帶植物科學, 2014, 43(4): 339-342.

6 Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One, 2010, 5(1): e8613.

7 Luo K, Chen S L, Chen K L, et al. Assessment of candidate plant DNA barcodes using the Rutaceae family. Sci China Life Sci, 2010, 53(6):701-708.

8 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430 (1-2): 50-57.

9 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very larger phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (30): 11030-11035.

10 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihyood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

11 盧瓏,沈麗,王雪妮,等.紫荊皮、紫金皮、昆明山海棠鎮(zhèn)痛作用比較研究.天津中醫(yī)藥大學學報, 2012, 31(3): 163-165.

Molecular Identification of Phyllanthus emblica and Their Adulterants via DNA Barcode

Huang Huiqing1, Huang Zhihai1, Huang Juan1, Zhang Jing1, Zhang Xiaoning2, Qiu Xiaohui1
(1. The 2ndClinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Chinese National Human Genome Center, Beijing / SinoGenoMax Co., Ltd / Beijing Key Laboratory of Genomics, Beijing 100176, China)

In order to guarantee the species correction of Phyllanthus emblica, a molecular identification method taken ITS2 as DNA barcode has been verified. Samples from P. emblica and its adulterants were collected, and their ITS2 regions were amplified and sequenced. Sequences were then assembled by CodonCode Aligner and analyzed with MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were computed and the phylogenetic tree was built using the neighbor-joining (NJ) and maximum likelihood (ML) trees. It was found that the length of ITS2 sequence of P. emblica was 208 bp. The K2P distance of the inter-specific samples between P. emblica and its adulterants ranged from 0.174 to 0.823. The phylogenetic tree indicated that P. emblica and its adulterants could be distinguished clearly. In conclusion, it was demonstrated that the ITS2 sequence was convevient for uncovering the molecular evidence behind the identification of P. emblica and its adulterants, and provided a fundation for identifying the original plants, which secured the safety and effectiveness of clinical medication.

Phyllanthus emblica, ITS2, molecular identification, adulterants, DNA barcode

10.11842/wst.2016.08.029

R282

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-07-28

修回日期：2016-08-10

＊ 廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負責人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：張曉檸，助理研究員，主要研究方向：分子生物學研究；丘小惠，研究員，主要研究方向：中藥質(zhì)量標準及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。