廣西特色蕉類種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析

鄒 瑜，何海旺，趙 明，龍 芳，武 鵬，林貴美，林 茜

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007)

廣西特色蕉類種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析

鄒 瑜1，何海旺1，趙 明1，龍 芳1，武 鵬1，林貴美2，林 茜1

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007)

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對廣西特色蕉類種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行分析。結(jié)果表明，從合成的35條ISSR引物中，篩選出13條條帶清晰、多態(tài)性豐富及重復(fù)性好的引物，共擴增出96條條帶，其中91條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性百分率達到93.69 %。65份特色蕉類種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.479167～1.000000之間，平均為0.804726。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.71時，可以將基因型為ABB的大蕉及粉蕉與其他基因型的蕉類種質(zhì)資源進行區(qū)分；遺傳相似系數(shù)在0.74時，能夠把大蕉和粉蕉區(qū)分開來。而在相似系數(shù)為0.76附近，大蕉種質(zhì)資源聚成3類，在0.92附近時，粉蕉種質(zhì)資源可聚為4類。

蕉類；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

香蕉(Musaspp.)屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)多年生草本植物，是世界上產(chǎn)量最大的水果作物之一，也是部分發(fā)展中國家的主要食物來源[1]。根據(jù)香蕉的植株形態(tài)和經(jīng)濟性狀，可將其分為香蕉(香牙蕉)、大蕉、粉蕉和龍牙蕉4大類。其中香蕉(香牙蕉)的種植面積和市場份額最大，故常以香蕉做為食用蕉的總稱。

香蕉起源于亞洲南部，原產(chǎn)地為東南亞和印度等地，包括我國華南地區(qū)[2-3]。廣西地處華南低緯度地區(qū)，西南毗鄰越南，具有得天獨厚的光、溫、水等氣候條件和優(yōu)越的地理位置，為蕉類種質(zhì)資源的生長和傳播提供條件，是我國主要的香蕉產(chǎn)區(qū)。在廣西，有大面積的香牙蕉、粉蕉及少量大蕉的栽培，經(jīng)過多年的引種交流、自然雜交和變異，及在廣西各地發(fā)現(xiàn)有豐富的野生蕉類種質(zhì)資源，造就了其蕉類資源豐富的遺傳多樣性[4]，這些豐富的種質(zhì)資源將為我國香蕉的新品種選育提供豐富的基因資源。但長期的引種交流及無性繁殖，也導(dǎo)致了大部分種質(zhì)出現(xiàn)同種異名或同名異種現(xiàn)象，給蕉類種質(zhì)的合理利用帶來極大的困擾。牟海飛等[3]等對32份香蕉品種(系)進行了遺傳多樣性分析，為香蕉的育種和遺傳改良提供重要依據(jù)。本文主要針對廣西的粉蕉、大蕉及野生蕉等特色蕉類種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行ISSR分析，為研究特色蕉類在廣西的傳播、演化以及新品種的選育提供依據(jù)。

表1 供試驗的65份特色蕉類種質(zhì)資源

1 材料與方法

1.1 試驗材料

65份供試材料為本課題組從廣西各地收集的具有特異性狀的特色蕉類種質(zhì)資源，包括粉蕉、大蕉以及野生蕉等，其試驗序號、種質(zhì)名稱及來源地見表1。

1.2 DNA提取

所有材料均取未展開心葉，立即用液氮速凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0531)提取蕉類種質(zhì)資源的DNA，提取方法參照試劑盒說明書。提取的DNA用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用分光光度計測定波長為260 nm時的吸光值，并計算DNA的濃度。將所有的DNA定量至50.0 ng/μl，存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

DNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×50

1.3 ISSR標(biāo)記及其產(chǎn)物電泳

引物設(shè)計參考前人發(fā)表的相前文獻[1,3,5-6]，所有引物均由北京六合華大基因股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25.0 μl，其中DNA模板0.5 μl、ISSR引物2 μl (10 μmol/L)和2×EsTaqMasterMix 12.5 μl(購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0718)。PCR反應(yīng)在Bio-RADicycle PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 2 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存待用。

1.4 統(tǒng)計分析

擴增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移位置，有帶(顯性)記為1；無帶(隱性)記為0，依此構(gòu)成0/1遺傳相似矩陣。僅記錄清晰、穩(wěn)定且可重復(fù)的條帶。二元數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS 2.1e軟件中的DICE法計算遺傳相似系數(shù)，UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕉類種質(zhì)資源的收集與基因組DNA的提取

十幾年來，收集了廣西中、南部的30多個縣(市轄區(qū)、縣級市)的粉蕉、大蕉、香牙蕉及部分野生蕉在內(nèi)的種質(zhì)資源。在收集到的種質(zhì)資源中，篩選出部分性狀優(yōu)良的單株進行試種，并通過提純復(fù)壯，最終選育出粉蕉優(yōu)良新品種金粉1號[7]和銀粉1號。為了對廣西的特色蕉類資源進行更進一步的研究，在收集到200余份的蕉類種質(zhì)資源中，篩選了65份特色蕉類種質(zhì)資源(表1)進行ISSR分子標(biāo)記分析。

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取蕉類種質(zhì)資源基因組DNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，所提取的65份DNA條帶清晰，均無蛋白質(zhì)、多糖及RNA條帶，純度較高，沒有明顯的降解現(xiàn)象，并且所有的DNA片段大小基本一致，說明提取的DNA適合后續(xù)的ISSR分析。

M:DL2000 DNA Marker; 1～24:部分份蕉類種質(zhì)資源圖1 部分供試香蕉材料基因組DNA電泳檢測結(jié)果Fig.1 Genomic DNA electrophoresis results of some tested banana materials

引物Primer引物序列(5'-3')SequenceTM(℃)最佳退火溫度(℃)Suitableannealingtemperature總條帶數(shù)(條)Totalamplifiedbands多態(tài)性條帶數(shù)(條)Numberofpolymorphicband多態(tài)性百分率(%)PercentageofpolymorphicbandUBC807(AG)8T50.054.41717100.00UBC810(GA)8T50.052.0131184.62UBC811(GA)8C52.059.766100.00UBC825(AC)8T50.050.344100.00UBC826(AC)8C52.051.077100.00UBC827(AC)8G52.050.366100.00UBC835(GA)8YC55.055.666100.00UBC836(AG)8YA53.050.388100.00UBC840(GA)8YT53.051.066100.00UBC841(GA)8YC55.053.26583.33UBC842(GA)8YG55.054.488100.00UBC880(GGAGA)348.050.355100.00UBC891HVH(TG)750.750.34250.00合計Total9691平均Average7.38793.69

2.2 ISSR引物退火溫度的篩選及擴增多態(tài)性

從設(shè)計的35條ISSR引物中篩選出13條擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物(表2)進行遺傳多樣性分析。為確定篩選出引物的最佳退火溫度，每條引物設(shè)計12個退火溫度梯度(50.0、50.5、51.0、52.0、53.2、54.4、55.6、56.8、58.0、59.0、59.5、60.0 ℃)進行實驗，由圖2可知，除引物UBC811的最佳退火溫度與TM值相差較大外，其他引物的最佳退火溫度均在TM值前后5 ℃的范圍內(nèi)。

從篩選出來的13條引物序列(圖2)可以看出，二堿基重復(fù)的引物共有12條，以AG、GA和AC二堿基重復(fù)的序列為主，說明收集到的特色蕉類種質(zhì)資源的基因組含有較多的AG、GA和AC的重復(fù)序列，可為今后分子標(biāo)記的引物設(shè)計提供參考。13條引物共擴增出96條條帶，每條引物能夠擴增出4～17條帶，平均為7.38條。其中以UBC807引物擴增的條帶數(shù)最多，達17條，而UBC810則次之(13條)。擴增的條帶中，有91條為多態(tài)性條帶，每條引物平均產(chǎn)生7條，平均多態(tài)性百分率達到93.69 %，多態(tài)性較高，說明收集的特色蕉類種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。

2.3 聚類分析結(jié)果

根據(jù)PCR擴增的結(jié)果(圖3)，統(tǒng)計條帶并構(gòu)建0、1二元數(shù)據(jù)庫，用NTSYS 2.10 e軟件計算廣西特色蕉類種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明：65份特色蕉類種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.479167到1.000000之間，平均為0.804726。其中46與59號、60與64號種質(zhì)資源之間的相似系數(shù)最小，均為0.479167，說明這些種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較遠。有部分種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)則較大，如10號(金粉1號)與5、9、11、13、16、18、30、31、32、34號等種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)為1.000000，說明它們之間的親緣關(guān)系較近，甚至有可能為同種異名。在廣西選育并大面積種植的粉蕉品種金粉1號(10號)與廣東選育的2個粉蕉品種：廣東粉蕉(12號)及粉雜(40號)之間的遺傳相似系數(shù)分別為0.989583及0.96875，說明這幾個栽培種的親緣關(guān)系均較近，但在遺傳上也存在一定的差異。

M：100+2+3 kb DNA ladder-M；1-12：50.0,50.5,51.0,52.0,53.2,54.4,55.6,56.8,58.0,59.0,59.5,60.0 ℃圖2 引物UBC825及UBC836有不同退火溫度下的PCR電泳圖Fig.2 Amplification result using primer UBC825 and UBC 836 at different annealing temperatures

1～65:65份蕉類種質(zhì)資源圖3 引物UBC807對65份蕉類種質(zhì)資源基因組DNA的PCR擴增結(jié)果Fig.3 ISSR fingerprinting of 65 banana germplasm resources with primer UBC807

由圖4可以看出，收集到的特色蕉類種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富，特別是野生的蕉類種質(zhì)資源與農(nóng)家種的蕉類品種之間差別比較顯著。遺傳相似系數(shù)為0.71時，可以將基因型為ABB的大蕉及粉蕉與其他基因型的蕉類種質(zhì)資源進行區(qū)分。遺傳相似系數(shù)在0.74時，可以將大蕉和粉蕉區(qū)分開來。不同地域收集到的大蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富，在相似系數(shù)為0.76附近，大蕉種質(zhì)資源聚為3類，第一類包括43、44、45及47四份種質(zhì)資源，第二類包括48、49、50、51、52、53、54、55及56號共9份大蕉種質(zhì)資源，而第三類僅有12及16號2份種質(zhì)資源。在相似系數(shù)為0.92時，粉蕉種質(zhì)資源可聚為4類，28及64號分別單獨為一類；24、26及29號3個種質(zhì)資源歸為一類；其余的再歸為一類，這一類包括常見的粉蕉栽培種，如：廣東粉蕉(12號)、粉雜(40號)、金粉1號(10號)及其變異株等。相對其它蕉類種質(zhì)資源來說，粉蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性較低，各個地域收集的種質(zhì)資源差別不大。如5、9、10(金粉1號)、11、13、16、18、30、31、32及34號，共11份種質(zhì)資源無法用本實驗的14條引物分開，說明它們之間的親緣關(guān)系極近，很可能與粉蕉栽培種金粉1號同種異名或是其變異株。此外，在收集種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)64號是一個特殊的種質(zhì)，其蕉果身披白粉，與銀粉1號品種類似，雄花的顏色也接近粉蕉，但其植株的外觀性狀及蕉果的外形卻與大蕉相同，因此，將其分類歸為粉大蕉。在本次的聚類中，64號聚于大蕉及粉蕉之間，但更偏向于粉蕉，因此推斷其基因組應(yīng)屬于ABB，但仍需進一步驗證。

3 討 論

研究表明，大多數(shù)植物的EST-SSR都是以三堿基重復(fù)為主，二堿基則次之[8-9]。而在二堿基重復(fù)的EST-SSR中，AG/TC重復(fù)單元最多，而GC/CG則最少，王靜毅等[10]的研究表明，在香蕉的EST-SSRs中，二、三核苷酸重復(fù)單元的SSR占主導(dǎo)地位，而GA則是二核苷酸中的優(yōu)勢重復(fù)類型。ISSR分子標(biāo)記是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR引物的3'或5'端加上2～4個隨機堿基，因此，ISSR同樣應(yīng)具有SSR引物類似的重復(fù)單元。劉紹欽等[11]從ISSR引物中篩選出了15條目標(biāo)引物，其中二堿基重復(fù)的引物占80 %，其研究結(jié)果與SSR類似。本實驗中，篩選出的13條引物有12條是二堿基重復(fù)，以AG、GA和AC二堿基重復(fù)為主，與前人的研究結(jié)果基本一致。

圖4 65份蕉類種質(zhì)資源的UPGMA聚類分析結(jié)果Fig.4 Dendrogram for 65 banana germplasm resources based on UPGMA analysis

據(jù)報道，香蕉種類多樣，種質(zhì)資源間的遺傳多樣性較為豐富[12-14]。在本研究中，收集到的特色蕉類種質(zhì)資源也具有豐富的多樣性，特別是野生蕉種與農(nóng)家種或栽培種之間存在著極大的差異，如在龍州縣收集的59號野生種與隆安縣收集的46號農(nóng)家大蕉品種之間遺傳相似系數(shù)僅為0.479167。蕉類種質(zhì)資源在遺傳上的巨大差異，將為今后的優(yōu)良基因的挖掘利用以及遺傳育種提供巨大的基因庫。

因為受到消費市場的限制，目前大蕉未能形成規(guī)模種植，僅作為農(nóng)家種有零星分布，且多為本地的野生種馴化，傳播范圍不大，因此，不同地域收集到的大蕉種質(zhì)資源親緣關(guān)系差別較大，該結(jié)果將為大蕉品種的遺傳改良提供理論依據(jù)。相對大蕉，粉蕉的遺傳多樣性則要小得多，可能是由于粉蕉由原產(chǎn)地傳到廣西后，其種群數(shù)較少，基因流動小。此外，近十幾年來，粉蕉組培苗的大面積推廣種植，也是粉蕉遺傳多樣性低的重要原因之一。

Amsellem等[15]的研究表明，由于外來種在新的生境中往往遭受瓶頸、建立者效應(yīng)等多種因素的影響，在新生境中時間越長，其遺傳多樣性越豐富，因此，可以根據(jù)其遺傳多樣性來推斷其傳播路線[16]。粉蕉在廣西又名西貢蕉或安南蕉。安南為越南古名，得名于唐代的安南都護府，而西貢則是越南胡志明市的舊稱，因此粉蕉可能是由越南經(jīng)邊界線傳入我國。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在中越邊境城市東興市境內(nèi)各鎮(zhèn)收集到的粉蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性最為豐富，在相似系數(shù)為0.92時聚類的4個的粉蕉分類中，有3類包含有東興市收集的種質(zhì)。龍州、憑祥、上思和百色等地的遺傳多樣性則較東興的小，南寧再次之，玉林市收集的種質(zhì)資源和廣東選育的品種的遺傳多樣性最小。因此，推測東興市可能是粉蕉進入我國定居的地區(qū)，然后經(jīng)陸路向憑祥、龍州、上思和百色等地擴散，再經(jīng)由河流或陸路傳至南寧市，最后傳到河流下游的玉林、廣東等地。但因本實驗樣本數(shù)量有限，所以粉蕉的傳播路線僅為初步判斷，實際結(jié)果仍需進一步驗證。

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(責(zé)任編輯 王冠玉)

Genetic Diversity Analysis of Distinctive Banana Germplasm Resources in Guangxi by Using ISSR Markers

ZOU Yu1, HE Hai-wang1, ZHAO Ming1, LONG Fang1, WU Peng1, LIN Gui-mei2, LIN Qian1

(1. Bio-technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China；2. Guangxi Plant Tissue Culture Seedlings Limited Company, Guangxi Nanning 530007, China)

Genetic diversity of 65 distinctive banana germplasm resources in Guangxi Zhuang Autonomous Region were studied by using ISSR markers in research. The results showed that 35 ISSR primers were screened, and 13 primers with clear band, more band number and good repeatability were selected. The 13 primers amplified 96 bands, out of which 91 bands were polymorphic, and the percentage of polymorphic loci was 93.69 %. Genetic similarity coefficient of 65 banana germplasm resources changed from 0.479167 to 1.000000, with an average of 0.804726. Cluster analysis results indicated that ABB genotypes could be separated clearly from other genotypes at 0.71similarity level, and the plantain could be separated from dwarf bananas at 0.74. Then the plantain germplasm resources could be classified into three groups at 0.76 similarity level while dwarf bananas be four groups at 0.92.

Banana; Germplasm resources; ISSR； Genetic diversity

1001-4829(2016)10-2450-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.037

2016-05-08

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-32-15)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(桂農(nóng)科2015YT54)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項目(桂農(nóng)科2016JZ03)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(桂農(nóng)科2017YM29)

鄒 瑜(1965-)，男，廣西容縣人，研究員，研究方向為香蕉栽培與育種，E-mail：zy@gxaas.net。

S668.1

A