徐嘉雯，龍?zhí)斐?，寧曦，張碧魚*

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 2.中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

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魚類血液白細(xì)胞的分類計數(shù)

徐嘉雯1，龍?zhí)斐?，寧曦2，張碧魚1*

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 2.中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

摘要：將三種魚類的血液涂片，經(jīng)瑞氏染料染色后，參照哺乳動物白細(xì)胞分類的染色標(biāo)準(zhǔn)和特征，能夠清楚地顯現(xiàn)出類似的嗜中、嗜堿和嗜酸性粒細(xì)胞，以及單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。魚類白細(xì)胞分類計數(shù)的結(jié)果，可以反映出魚體血液功能的變化情況。魚的種屬不同，分類計數(shù)也表現(xiàn)出不同。魚類白細(xì)胞的分類計數(shù)移植了哺乳動物的血常規(guī)方法，只是在取魚樣和使用抗凝劑等技術(shù)細(xì)節(jié)上做了些改進(jìn)。其技術(shù)方法簡便可靠，分辨率高，重復(fù)性好，可作為一種檢測指標(biāo)，直接應(yīng)用到魚類病理生理學(xué)研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

關(guān)鍵詞：魚類白細(xì)胞血液涂片白細(xì)胞分類計數(shù)

血常規(guī)檢測，一直是血液生理學(xué)中的經(jīng)典實驗，常采用人或其他哺乳動物的血樣。但對于普通生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和水產(chǎn)科學(xué)等專業(yè)的本科教學(xué)而言，可用魚血作為血樣，移植哺乳動物血常規(guī)的實驗方法，這樣既降低了教學(xué)實驗的成本，又豐富了實驗內(nèi)容。尤其是魚類白細(xì)胞的分類計數(shù)的實驗，將其與哺乳動物的白細(xì)胞分類計數(shù)的實驗結(jié)果平行對照，有助于理解血細(xì)胞的生成、分化和成熟的發(fā)育過程；也可作為一種檢測指標(biāo)，應(yīng)用到魚類病理生理學(xué)、環(huán)境脅迫生物學(xué)的研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)實踐中。

動物血液是由血細(xì)胞和血漿組成的。血液中的血細(xì)胞可劃分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板三大類。白細(xì)胞（leucocyte）是血液中除紅細(xì)胞、血小板以外其他多種血細(xì)胞的總稱，其組織形態(tài)特征各異［1，2］。血細(xì)胞的計數(shù)和分類，常與動物的病理生理狀態(tài)有關(guān)。白細(xì)胞分類計數(shù)是通過統(tǒng)計血液樣本不重復(fù)的100個白細(xì)胞中不同類別的白細(xì)胞數(shù)量，確定各類白細(xì)胞的組成比例［3］。白細(xì)胞比例的任何異?；蛎黠@改變，都可能意味著疾病的發(fā)生。

魚類白細(xì)胞的形態(tài)特征及細(xì)胞顆粒對染料的親和反應(yīng)與哺乳動物相似，其劃分及命名，可采用哺乳動物白細(xì)胞分類上所用的方法。即將白細(xì)胞分為顆粒白細(xì)胞和無顆粒白細(xì)胞。顆粒白細(xì)胞又分為中性、嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞；無顆粒白細(xì)胞包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［4，5］。

目前可以肯定的是，魚類外周血液中白細(xì)胞的種類、數(shù)量及其形態(tài)特征存在種屬間的差異，魚類是否存在嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞也有一定的爭論［5，6］，染色的方法和分類的標(biāo)準(zhǔn)尚需要統(tǒng)一。本文利用南方市場上常見的三種魚類的血液樣本，開發(fā)出魚類白細(xì)胞分類計數(shù)的成熟的教學(xué)實驗提供如下，并對三種魚類血樣的實驗結(jié)果進(jìn)行了比較和分析。希望能為血液生物學(xué)的教學(xué)實驗提供參考。

1實驗材料與方法

白鯽（Carassius auratus），鯉魚（Cyprinus carpio），羅非魚（Oreochromis mossambicus），體重400～600 g，各12尾，1～2齡，不分雌雄。

從魚尾柄腹面正中進(jìn)針，于血管棘之間的尾靜脈/動脈處取血［4］。用3.2%的檸檬酸鈉液作抗凝劑。取血后，血液樣本加入盛有抗凝劑（每ml血液樣本檸檬酸鈉6 mg）的試管中，在室溫下靜置30 min，待多數(shù)紅細(xì)胞自然沉降后，用尖頭吸管緊貼紅細(xì)胞分層處吸取一滴血液，按常規(guī)做血液涂片，每尾魚的血樣做10張涂片。涂片晾干后，用瑞式染料染色（wright染色）。經(jīng)染色并晾干后的血涂片放在顯微鏡載物臺上，加一小滴香柏油，用光學(xué)顯微鏡的油鏡（×100）進(jìn)行觀察，注意顯微鏡的集光器孔徑光欄，要與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配。

2實驗結(jié)果

2.1白細(xì)胞染色與形態(tài)特征

按照哺乳動物白細(xì)胞分類鑒別的方法，在瑞式染色后的血涂片上，各種白細(xì)胞清晰可見圖1，圖2，圖3。

嗜中性粒細(xì)胞：細(xì)胞近圓形，大小與紅細(xì)胞相差無幾（魚血紅細(xì)胞呈橢圓形），但在鯉魚和白鯽中也有一些較大體積的嗜中性粒細(xì)胞。與嗜酸或嗜堿性粒細(xì)胞比較，胞質(zhì)中顆粒較小，淡藍(lán)紫色偏紅；白鯽和鯉魚的嗜中性粒細(xì)胞胞漿中有較大區(qū)域的淡紅色，而羅非魚的嗜中性粒細(xì)胞胞漿染色較為均勻，淡藍(lán)紫色，無淡紅色區(qū)域。細(xì)胞核染成很深的藍(lán)紫色，核基本不分葉，也有分成2葉核的，部分細(xì)胞核呈腎形或馬蹄形。鯉魚的核分葉的情況較為明顯，常見有多葉核的嗜中性粒細(xì)胞。沒有分葉的細(xì)胞核較大，偏于細(xì)胞的一側(cè)。

嗜酸性粒細(xì)胞：細(xì)胞近圓形，體積與嗜中性粒細(xì)胞相近或稍大。胞質(zhì)中粗大的顆粒呈桔紅色。核深紫紅色，不分葉，偏于細(xì)胞一側(cè)。染色較深時，常不能分辯出細(xì)胞核。

嗜堿性粒細(xì)胞：細(xì)胞形狀與大小接近其他粒細(xì)胞。胞質(zhì)中顆粒也較為粗大，呈深藍(lán)紫色或藍(lán)褐色。核基本位于細(xì)胞中央，不分葉，染紫紅色稍淺，也有被胞質(zhì)遮蓋的情形。

單核細(xì)胞：細(xì)胞多為圓形，體積常大于紅細(xì)胞和顆粒白細(xì)胞，部分細(xì)胞輪廓不規(guī)則。細(xì)胞質(zhì)呈灰藍(lán)色，胞質(zhì)中微細(xì)顆粒似灰塵狀，整體著色較淡，有小的液泡（空泡）和少量的嗜天青顆粒。細(xì)胞核較?。ㄓ绕涫求w積比小），偶有呈腎形，染成紫褐色，偏于細(xì)胞的一側(cè)。

淋巴細(xì)胞：細(xì)胞圓形，體積小于其他白細(xì)胞，徑向約為4~5 μm。胞質(zhì)很少呈淡藍(lán)色，僅有一薄層圍繞在核周圍。細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核的一側(cè)有時可看到淺的凹痕。核很大，占細(xì)胞的大部分，被染成深藍(lán)紫色。白鯽和鯉魚的血涂片中具有很多小淋巴細(xì)胞，大小約為2~3 μm。

圖1白鯽的血細(xì)胞

圖2鯉魚的血細(xì)胞

圖3羅非魚的血細(xì)胞

2.2白細(xì)胞的分類計數(shù)

依據(jù)各類白細(xì)胞的特征，對觀察到的細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)，計算各類白細(xì)胞所占的百分比。結(jié)果，見表1。

表1魚血液樣本中白細(xì)胞的分類計數(shù)（±s）

3　討論

1.瑞式染色后的魚類血液涂片上，可以按照哺乳動物白細(xì)胞分類的標(biāo)準(zhǔn)，將血類白細(xì)胞清晰的劃分為嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。白細(xì)胞中又以淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量最多，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量最少，其單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的比例都高過哺乳動物。

以往的研究認(rèn)為硬骨魚類缺乏或僅部分種類具有嗜堿性粒細(xì)胞，但在本文的實驗中，三種魚類都具有嗜堿性粒細(xì)胞，且比例高過各自血液中的嗜酸性粒細(xì)胞。

2.實驗用白鯽和鯉魚在分類上屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉形目為魚類中第二大目，其多為淡水魚；而羅非魚屬鱸形目（Perciformes），鱸形目為魚類中最大的一個目，其種類多為海水魚［1］。實驗結(jié)果表明，白鯽和鯉魚白細(xì)胞染色的特征和分類計數(shù)都十分接近。白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞最多，其次是嗜中性粒細(xì)胞；嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞染色的特征也幾乎相同（圖1、圖2）；淋巴細(xì)胞中都有許多的小淋巴細(xì)胞。但羅非魚白細(xì)胞中卻是嗜中性粒細(xì)胞居多，尤其是嗜中性粒細(xì)胞較少見分葉現(xiàn)象，胞質(zhì)染色的特征也與白鯽和鯉魚不同，也幾乎沒有小淋巴細(xì)胞（圖1、圖2、圖3）。由此可見，魚類白細(xì)胞的種類、特征和數(shù)量是有種屬間的差別。另外實驗中也發(fā)現(xiàn)，因抽取不成功而多次取血的鯉魚，其血液中的單核細(xì)胞會明顯增多。這也意味著白細(xì)胞的數(shù)量可能與魚的狀態(tài)有關(guān)。

3.用于魚類血液的抗凝劑可有多種選擇。本文實驗中選用3.2%的檸檬酸鈉溶液，證明實驗效果較好［7］。在實驗室常用的抗凝劑中，肝素用于魚血，其抗凝效果較差；雙草酸鹽抗凝血的效果較好，但會引起血栓細(xì)胞聚集，白細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變［4］；用于哺乳動物的EDTA鈉鹽（二、乙二胺四乙酸鹽），會導(dǎo)致魚血細(xì)胞破裂。

4.哺乳動物白細(xì)胞分類計數(shù)的方法完全可以移植到魚類，且操作簡捷，分辨率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。而哺乳動物血常規(guī)檢測中的白細(xì)胞（含紅細(xì)胞）的整體計數(shù)方法用于魚類，還有待商榷。

哺乳動物白細(xì)胞計數(shù)常用的醋酸-龍膽紫稀釋液，是不能象林光華等人那樣直接用于魚類血細(xì)胞的計數(shù)［8，9］。因為對于哺乳動物而言，醋酸作為脂溶劑破壞細(xì)胞膜后，紅細(xì)胞成了“影子”，留下白細(xì)胞的細(xì)胞核，被龍膽紫染色后，可在顯微鏡下計數(shù)。而魚類的紅細(xì)胞是有細(xì)胞核的。顯然，這樣的方法不能滿足實驗要求。雙染料稀釋液（中性紅＋結(jié)晶紫或俾士麥棕＋結(jié)晶紫），也常因低倍光學(xué)顯微鏡下，很難區(qū)分白細(xì)胞與紅細(xì)胞染色的不同，而導(dǎo)致實驗結(jié)果不可靠。

盡管魚類白細(xì)胞的分類計數(shù)，是否能用來準(zhǔn)確地評價魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對環(huán)境的適應(yīng)狀況，還有待進(jìn)一步更為深入、廣泛的實驗研究。但目前看來，白細(xì)胞分類計數(shù)的方法較為成熟，最有可能成為一種可靠的魚類生理、病理和毒理學(xué)的血常規(guī)指標(biāo)。既使將此方法，用于海洋生物學(xué)、水生生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)的教學(xué)實驗，也是一種不錯的選擇。

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【責(zé)任編輯：鄧軍文dengjunwen69@126.com】

Differential white blood cell count of fishes

XUJia- wen1, LONGTian- cheng1, NINGXi2, ZHANGBi- yu1
（1.School of Life Science, Sun Yat- Sen University, Guangdong, Guangzhou 510275, China；2. School of Marine Science, Sun Yat- Sen University, Guangdong, Guangzhou 510275, China）

Abstract:Three kinds of fish blood smears are stained with Wright’s staining. Neutrophils, basophils, eosinophils, lymphocytes and monocytes are detected referring to the standard mammalian leukocyte classification and characteristics. The results can reflect the change of fish blood function. If fish species are different, classifying and counting also showdifferent. The method of differential white blood cell count of fishes is same as routine method in mammals, but taking fish’s blood samples and the use of anticoagulants and other technical details make some improvement. The method is simple and reliable, high resolution, good reproducibility. It can be used as a detection index, applied directly to the pathophysiology of fish and aquaculture.

Keywords:fishes white blood cell; blood smear; white blood cell count

*通信作者：張碧魚（1979-），女，福建漳州人，中山大學(xué)助理實驗師。

作者簡介：徐嘉雯（1991-）,女，廣東肇慶人，中山大學(xué)博士研究生。

收稿日期：2015-11-23

文章編號：1008- 0171（2016）01- 0023- 04

中圖分類號：Q959.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A