張鐘仁,陳　鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

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苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的分離純化及瞬時轉(zhuǎn)化

張鐘仁,陳鵬*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

摘要:高效分離原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合和再生培養(yǎng)的基礎(chǔ)性工作。該實驗以苦蕎(Fagopyrum tartaricum) 品種‘榆6-21’的葉肉細(xì)胞為材料,研究了酶類組合、甘露醇濃度、酶解時間以及離心速度對苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離純化的影響。結(jié)果表明:酶解液組成為1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1%牛血清白蛋白,以第5～7片真葉為材料,用膠帶紙撕去葉片下表皮后,25 ℃黑暗酶解4 h,以900 r/min離心收集,可以獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)6×106個/g,活力達(dá)到90%以上;用雙熒光素酶報告基因載體檢測原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率,以分離純化的苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體為受體,將雙熒光素酶報告基因載體與其混合后,在終濃度為20% PEG4000介導(dǎo)下,黑暗轉(zhuǎn)化20 min,可以檢測到較高活性的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶,證明雙熒光素酶報告載體可成功轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中。研究結(jié)果為苦蕎原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化及遺傳操作提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:苦蕎;原生質(zhì)體;分離和純化;瞬時轉(zhuǎn)化;雙熒光素酶報告載體

植物原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁后的,僅有一個被質(zhì)膜包圍而生存的裸露細(xì)胞。去除了細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體,仍保持著細(xì)胞全能性,在適宜的條件下,可以再生成新的與其相似的個體[1]。因此被廣泛用于遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合[2]以及細(xì)胞體突變[3-5]。

植物原生質(zhì)體的分離和純化,是原生質(zhì)體融合以及植物體再生研究的基礎(chǔ)[6]。植物原生質(zhì)體是研究細(xì)胞生理功能的一種理想的材料,同時也是原生質(zhì)體融合以及外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的合適受體。原生質(zhì)體的研究將為基因工程和細(xì)胞工程的研究提供廣闊的前景[1,7]。要實現(xiàn)植物原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化及其再生培養(yǎng),就需要獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的原生質(zhì)體。關(guān)于原生質(zhì)體的分離方法主要有機(jī)械法、化學(xué)法和酶解法等。其中,應(yīng)用最廣泛、最快速有效分離原生質(zhì)體的方法是酶解法[8-10]。在分離和純化大量有活力的植物原生質(zhì)體的過程中受到多種因素的影響,例如酶類配比[11]、酶解時間[12]、滲透壓濃度[13]以及材料的生長狀態(tài)等。關(guān)于植物原生質(zhì)體的分離和純化的方法在擬南芥[14]、煙草[15]、玉米[16]、水稻[17]等植物中已有報道。由于不同植物細(xì)胞壁組成成分不同,因此在分離和純化原生質(zhì)體的過程中,方法也略有差別。

苦蕎在中國歷史悠久,營養(yǎng)豐富,是一種重要的藥糧兼用作物。但由于其生長周期較長,遺傳背景較為復(fù)雜,通過傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行品質(zhì)改良均存在一定困難,使得有關(guān)苦蕎分子機(jī)制的研究困難重重,而原生質(zhì)體作為單細(xì)胞系統(tǒng),是研究植物生理生化過程和遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體。目前,關(guān)于苦蕎原生質(zhì)體的制備方法還未見報。因此開展苦蕎原生質(zhì)體制備和瞬時轉(zhuǎn)化體系的研究迫在眉睫。本研究以苦蕎品種‘榆6-21’葉片為材料,研究酶類配比、酶解時間、甘露醇濃度和離心強(qiáng)度對苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離純化效果和活力的影響,以期建立獲得高質(zhì)量的苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的方法,為利用原生質(zhì)體進(jìn)行苦蕎的遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合和再生培養(yǎng)等研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

苦蕎‘榆6-21’由榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校提供,常規(guī)種植管理至幼苗有8片真葉時待用。主要試劑有纖維素酶(R-10,Yakult Honsha)、離析酶(R-10,Yakult Honsha)、二乙酸熒光素(FDA,aladdin)、甘露醇(Amresco,USP級)、牛血清白蛋白(BSA,Sigma)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES,Genview)和雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)試劑盒(dual-luciferase?reporter assay system,promega)。

1.2方法

1.2.1葉片處理選取完全展開的第5～7片真葉,用無菌水沖洗干凈,之后用75%酒精浸泡30 s,再用無菌水沖洗干凈,用濾紙吸干表面的水分后,參照Wu等[18]的方法,用膠帶紙將葉片正反兩面粘住,輕輕撕去粘在葉片下表皮上的膠帶,使葉肉細(xì)胞暴露,用于原生質(zhì)體分離。

1.2.2原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體分離的方法參照Yoo等[14]的方法,并略作修改。使用不同濃度纖維素酶R-10和離析酶R-10的酶類組合(表1),酶溶劑為20 mmol/L KCl、20 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)和不同濃度甘露醇(0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 mol/L)的混合液,用KOH調(diào)節(jié)pH至5.7,將酶解液放入55 ℃水浴鍋中加熱10 min,待恢復(fù)至室溫后,加入10 mmol/L CaCl2、0.1% BSA,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾滅菌。按0.8∶10(即0.8 g去掉下表皮的葉片加10 mL酶解液)的比例將去掉下表皮的葉片加入到酶解液中,于40 r/min、25 ℃黑暗條件下酶解處理2～10 h,每隔2 h在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的形態(tài)和活力,選取膜結(jié)構(gòu)完整和在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體計數(shù),確定最佳酶解時間。實驗重復(fù)3次。

1.2.3原生質(zhì)體的純化酶解結(jié)束后,向酶解混合物中加入等體積的W5溶液(2 mmol/L MES+154 mmol/L NaCl+125 mmol/L CaCl2+5 mmol/L KCl,用KOH調(diào)節(jié)pH至5.7),經(jīng)200目紗布過濾后,于不同離心速度(600、900和1 200 r/min)下,室

表1　不同濃度的酶類組合

溫離心4 min,棄上清收集原生質(zhì)體,之后再加入3 mL W5溶液重懸后,冰上放置30 min,再次離心4 min,棄上清。加入1 mL W5溶液重懸,得到純化后的原生質(zhì)體。

1.2.4原生質(zhì)體的計數(shù)與活力測定將原生質(zhì)體溶液用W5溶液稀釋后,取上述少量溶液滴加在0.1 mm血球計數(shù)板上,在光學(xué)顯微鏡下觀察,選取膜結(jié)構(gòu)完整的原生質(zhì)體進(jìn)行計數(shù)。每個樣品計數(shù)3個重復(fù),取平均值,最后計算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/g)=(5個大方格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)×5×104×稀釋倍數(shù))/葉片總質(zhì)量

原生質(zhì)體活力的測定用0.01%二乙酸熒光素(FDA)對其進(jìn)行染色。將FDA溶于丙酮中,配成濃度為5 mg/mL溶液,于4 ℃保存。染色時將FDA加入用W5溶液懸浮的原生質(zhì)體中,使其終濃度為100 μg/mL,黑暗處理10 min,并用W5溶液洗2次后立即在熒光顯微鏡下觀察,選取在488 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體進(jìn)行計數(shù)。每個樣品計數(shù)3個重復(fù),取平均值,最后計算原生質(zhì)體活力。

原生質(zhì)體活力=(發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體/原生質(zhì)體總數(shù))×100%

1.2.5原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化(1)雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建選用pGL3-Basic(Promega)載體作為骨架,該載體自身帶有螢火蟲熒光素酶(Photinuspyralis)開放閱讀框,但該閱讀框沒有啟動子。用2對分別帶有SacⅠ-NheⅠ和HindⅢ-NcoⅠ酶切位點的引物,利用PCR技術(shù)從pCAMBIA3301質(zhì)粒上分別擴(kuò)增出35S啟動子;用帶有NheⅠ-HindⅢ酶切位點的引物利用PCR技術(shù)從pRL-TK(Promega)質(zhì)粒上擴(kuò)增出帶有海腎熒光素酶(Renillareniformis)開放閱讀框和胭脂堿合酶終止子(NOS)的片段。將上述3個片段膠回收后,分別用各引物特定的限制性內(nèi)切酶在37 ℃雙酶切3 h,采用逐次連接的方法,將酶切好的插入片段與相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切的pGL3-Basic載體相連接,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定為陽性的克隆送往北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序鑒定,測序正確的重組質(zhì)粒命名為雙熒光素酶報告基因載體。

(2)PEG-Ca2+介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將純化的原生質(zhì)體在冰上靜置15 min后,室溫離心棄上清,用MMG溶液(4 mmol/L MES+0.4 mol/L甘露醇+15 mmol/L MgCl2,用KOH調(diào)節(jié)pH至5.7)重懸原生質(zhì)體,使其數(shù)量達(dá)到2×105個/mL。向2 mL離心管中依次加入10 μL含有雙熒光素酶報告基因載體的質(zhì)粒(2 000 ng/μL),100 μL原生質(zhì)體和110 μL PEG4000-Ca2+溶液[40%(W/V) PEG4000+0.2 mol/L甘露醇+100 mmol/L CaCl2],混勻后,黑暗25 ℃放置20 min,加入440 μL W5溶液終止反應(yīng),室溫離心棄上清后,用1 mL WI溶液(4 mmol/L MES+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L KCl,用KOH調(diào)節(jié)pH至5.7)重懸原生質(zhì)體,并轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。25 ℃靜置培養(yǎng)20 h后,將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中,離心收集原生質(zhì)體,加入50 μL原生質(zhì)體裂解液(100 mmol/L K3PO4+1 mmol/L DTT,用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.8),冰上放置5 min,12 000 r/min離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈1.5 mL離心管中。參照Promega公司的雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)試劑盒(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)說明書,先加入100 μL螢火蟲熒光素酶測定液(luciferase assay reagentⅡ),混勻后,通過化學(xué)發(fā)光儀GloMax?20/20 Luminometer(Promega公司)檢測螢火蟲熒光素酶(Fluc)活性,再加入100 μL海腎熒光素酶測定液(Stop&Glo?Reagent),混勻后,檢測海腎熒光素酶(Rluc)活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.6數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,并用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗,所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示,并用Origin 8.0作圖。

2結(jié)果與分析

2.1酶對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

以苦蕎葉肉細(xì)胞為材料,使用不同濃度酶類組合,0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液,黑暗酶解處理4 h,以900 r/min離心收集原生質(zhì)體,結(jié)果(圖1)顯示,當(dāng)纖維素酶濃度為1%時,原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著低于其它酶濃度組合(P<0.05),隨著纖維素酶濃度的升高,原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯增多。當(dāng)使用1.5%纖維素酶R-10和0.5%離析酶R-10時,原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均達(dá)到最大值,分別為6.33×106個/g和91.5%。繼續(xù)增加兩種酶的濃度后,原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均顯著降低(P<0.05),說明高濃度的酶液在裂解細(xì)胞的同時,對原生質(zhì)體本身也存在一定的傷害。本研究表明酶解液中最佳的纖維素酶R-10和離析酶R-10的濃度分別是1.5%和0.5%。

2.2甘露醇對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

以苦蕎葉肉細(xì)胞為材料,使用1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA的酶液組合,以不同濃度甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓,黑暗酶解處理4 h,900 r/min離心收集原生質(zhì)體,結(jié)果(圖2)顯示,當(dāng)甘露醇濃度為0.2 mol/L時,原生質(zhì)體產(chǎn)量很低(2.12×106個/g),這是因為滲透壓低導(dǎo)致原生質(zhì)體脹破。隨著甘露醇濃度升高,原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均顯著提高(P<0.05)。當(dāng)甘露醇濃度為0.5 mol/L時,原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均達(dá)到最大值,分別為6.66×106個/g 和91.8%。繼續(xù)增加甘露醇濃度(0.6 mol/L),原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力分別下降了29.4%和19.1%,均達(dá)到顯著水平(P<0.05),主要是由于滲透壓過高導(dǎo)致原生質(zhì)體在離心時難以沉降,同時高滲造成原生質(zhì)體皺縮,活力降低。因此,酶解液中最佳甘露醇濃度為0.5 mol/L。

2.3酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

以苦蕎葉肉細(xì)胞為材料,使用1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶液組合,黑暗酶解處理2～10 h,900 r/min離心收集原生質(zhì)體。結(jié)果(圖3)顯示,在酶解時間為2～4 h內(nèi),原生質(zhì)體產(chǎn)量隨時間增加而顯著增加(P<0.05)。酶解4 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均達(dá)到最大值,分別為6.58×106個/g 和90.3%。繼續(xù)增加酶解時間(6、8和10 h),原生質(zhì)體產(chǎn)量分別下降43.0%、40.5%和81.6%,原生質(zhì)體活力下降12.2%、13.2%和37.9%,均達(dá)顯著水平(P<0.05),說明過長的酶解時間對原生質(zhì)體有一定的負(fù)作用,導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。由此可見,最適宜酶解時間為4 h。

C1、C2、C3、M1、M2分別是1%纖維素酶、

2.4離心速度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

以苦蕎葉肉細(xì)胞為材料,使用1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液,黑暗酶解處理4 h,不同離心速度下收集原生質(zhì)體,結(jié)果(圖4)顯示,隨著離心速度的增加,原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低,而原生質(zhì)體活力逐步降低。當(dāng)離心速度由600 r/min升高到900 r/min時,原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著提高64.8%(P<0.05),并在900 r/min時達(dá)到最大值(6.25×106個/g)。當(dāng)離心速度為600 r/min時,原生質(zhì)體活力最高,達(dá)到93.3%,但與離心速度為900 r/min時收集得到的原生質(zhì)體活力(91.3%)差異不顯著(P>0.05)。綜上分析,收集原生質(zhì)體時最佳離心速度為900 r/min。

圖2　甘露醇對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

圖3　酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

2.5原生質(zhì)體活力檢測

FDA是一種親脂性物質(zhì),可以透過原生質(zhì)體膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,被胞內(nèi)酯酶分解成一種發(fā)熒光的親脂性物質(zhì),因此,可以用來檢測細(xì)胞膜的完整性,熒光越強(qiáng)表示原生質(zhì)體活力越高。圖5,A、B分別表示在可見光下純化后的原生質(zhì)體、488 nm激發(fā)光下經(jīng)FDA染色后發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體?？梢杂^察到,FDA可定位于細(xì)胞膜,指示細(xì)胞膜的完整性,說明在本實驗條件下獲得的原生質(zhì)體活力較高。

圖4　離心速度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

A.可見光下的原生質(zhì)體;B.經(jīng)FDA染色后的原生質(zhì)體

Fluc.螢火蟲熒光素酶;Rluc.海腎熒光素酶;

2.6原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率檢測

將經(jīng)測序鑒定正確的由2個35S啟動子分別驅(qū)動螢火蟲熒光素酶(Fluc)和海腎熒光素酶(Rluc)的雙熒光素酶報告基因載體,與純化后的原生質(zhì)體混合后,在終濃度為20% PEG4000介導(dǎo)下,黑暗轉(zhuǎn)化20 min后,用WI溶液重懸轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體并過夜培養(yǎng)后,使用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)試劑盒(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)檢測,結(jié)果(圖6)顯示,轉(zhuǎn)入雙熒光素酶報告基因載體后,2種熒光強(qiáng)度分別達(dá)到2.76×105和1.95×105,相比對照顯著提高了1 545和1 494倍(P<0.05),表明雙熒光素酶報告基因載體可成功轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中,進(jìn)一步說明了利用本研究方法制備的原生質(zhì)體可滿足苦蕎瞬時轉(zhuǎn)化研究的需求。

3討論

苦蕎作為一種重要的藥糧兼用作物,由于其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺乏使得關(guān)于其遺傳轉(zhuǎn)化的研究寸步難行,而使用原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時表達(dá)則克服了這一障礙,由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障,因而使其具有特殊的優(yōu)點,當(dāng)使用原生質(zhì)體作為受體時,外源基因更易于轉(zhuǎn)化,經(jīng)培養(yǎng)、選擇和分化后,便可以獲得基因工程植株。目前,關(guān)于苦蕎原生質(zhì)體制備方法的研究尚未見報道。因此,關(guān)于苦蕎原生質(zhì)體制備方法的研究不僅成為研究其體細(xì)胞遺傳、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、建立再生體系的理想材料,更是生物工程及品質(zhì)改良的有效手段。

不同植物原生質(zhì)體制備體系不盡相同,原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力與材料的選擇、酶類組合、酶解時間以及滲透壓等因素密切相關(guān)。分離和純化得到的原生質(zhì)體通常是用來研究啟動子活性、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等。幼嫩組織分離得到的原生質(zhì)體活力相對較高,外源基因轉(zhuǎn)化率也相對較高,因此選擇健康適宜生長階段的葉片對于原生質(zhì)體的分離非常重要。本研究在前期的預(yù)實驗中,確定選用第5至7片真葉最佳(結(jié)果未顯示),在未去除葉片下表皮的前提下,各種酶類組合均出現(xiàn)細(xì)胞壁去除不完全、細(xì)胞成團(tuán)等現(xiàn)象,利用膠帶撕去下表皮再進(jìn)行酶解,酶解效果良好。本研究以苦蕎葉片為材料,系統(tǒng)分析了分離純化原生質(zhì)體過程中酶類組合、甘露醇濃度、酶解時間與離心速度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響,結(jié)果表明,以苦蕎葉片為材料,在1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液中,黑暗處理4 h,900 r/min離心速度收集原生質(zhì)體,可以獲得大量、細(xì)胞膜完整、高活力的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的產(chǎn)量為6×106個/g,活力達(dá)到90%以上。

在原生質(zhì)體制備過程中,消化酶直接影響原生質(zhì)體產(chǎn)量[19],通常用纖維素酶、果膠酶、離析酶、半纖維素酶等來酶解細(xì)胞壁,其中使用最多的是纖維素酶和離析酶[14]。廖嘉明等[20]、Huang等[21]、陳名紅等[22]分別在研究擬南芥、黃瓜和煙草原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化時,均使用這2種酶獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為每克2.91×106、6～7×106和10×106個,本研究用1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10消化苦蕎葉片獲得足夠量的原生質(zhì)體(6×106)。

當(dāng)原生質(zhì)體與外界酶解液不能保持等滲時,原生質(zhì)體會發(fā)生破裂或皺縮,因此,在酶解液中添加滲透壓穩(wěn)定劑是非常重要的[23]。常用的滲透壓穩(wěn)定劑有無機(jī)鹽(KCl、NaCl、MgSO4)、糖類物質(zhì)(甘露醇、蔗糖、山梨醇),或者是這些物質(zhì)混合使用[20],不同的材料需要的滲透壓穩(wěn)定劑濃度不同[14,17-18],大多使用甘露醇來調(diào)節(jié)滲透壓,濃度一般在0.3～0.8 mol/L范圍內(nèi),Yoo等[14]在分離擬南芥葉肉原生質(zhì)體時甘露醇濃度為0.4 mol/L,舒小娟等[23]在分離葡萄葉片原生質(zhì)體時甘露醇濃度則為0.6 mol/L,而本研究中分離苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體時最佳甘露醇濃度為0.5 mol/L,這可能是因為不同植物細(xì)胞質(zhì)的濃度不同。

酶解時間是另一個獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的重要條件,酶解時間的選擇根據(jù)材料的不同而有所差異[14]。酶解時間過短,導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量低,無法滿足下游實驗需要,酶解時間過長,對原生質(zhì)體又有傷害,導(dǎo)致原生質(zhì)體活力降低[24]。Wu等[18]使用膠帶去掉擬南芥葉片下表皮后,酶解時間需要20～ 60 min,本研究中苦蕎葉片在去掉下表皮后,分離原生質(zhì)體的最佳酶解時間為4 h?？梢姴煌参飳γ附鈺r間的需求是不同的,這可能與材料、酶的種類和濃度等因素有關(guān),因此,要根據(jù)具體情況進(jìn)行探索。

在原生質(zhì)體的收集過程中,離心速度將直接影響原生質(zhì)的產(chǎn)量[25]。適宜的離心速度不僅能保證原生質(zhì)體不被外力所破壞,同時還能最大程度地得到高質(zhì)量的原生質(zhì)體。另外,原生質(zhì)體沒有了細(xì)胞壁的保護(hù),很容易發(fā)生破裂,在純化過程中應(yīng)盡量減少攪拌、震蕩等外界物理因素的沖擊破壞。

FDA是一種親脂性物質(zhì),本身無熒光,只有透過有活力的原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,在熒光顯微鏡下才能產(chǎn)生熒光,而破碎或者無活力的原生質(zhì)體則不能產(chǎn)生熒光。因此,可以用它檢測細(xì)胞膜的完整性。

原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化是進(jìn)一步驗證原生質(zhì)體質(zhì)量和活力的重要手段。本研究在優(yōu)化建立苦蕎原生質(zhì)體制備方法的基礎(chǔ)上,在PEG-Ca2+的介導(dǎo)下利用雙熒光素酶報告基因載體進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化,可檢測到高活性的螢火蟲熒光素酶和海腎熒熒光素酶,進(jìn)一步證明該體系制備的原生質(zhì)體應(yīng)用于瞬時表達(dá)分析的可行性。本研究構(gòu)建的雙熒光素酶報告基因載體可用來進(jìn)行啟動子活性分析,其含有的兩個35S啟動子分別驅(qū)動螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶兩個基因的表達(dá),將其中的一個35S啟動子替換為待檢測基因的啟動子區(qū)域,以另一個保留的35S啟動子驅(qū)動的熒光素酶作為內(nèi)參,通過分析轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體中Fluc與Rluc的酶活性比值可分析待測基因啟動子的活性,該系統(tǒng)可以有效克服原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中各樣品間的誤差。本研究制備的原生質(zhì)體完全能夠滿足后續(xù)試驗的要求,為外源基因遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合和苦蕎再生培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Isolation,Purification and Transient Expression of Mesophyll Protoplast in Tartary Buckwheat

ZHANG Zhongren,CHEN Peng*

(College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:The basic work for the system establishment about genetic transformation,cell fusion and regeneration is to formulate efficient protoplast isolation system.The influence of different factors such as enzyme liquid combination,mannitol concentration,enzymatic hydrolysis time and centrifugal speeds on the isolation and purification of protoplast from tartary buckwheat ‘YU 6-21’ mesophyll cells were studied.The results showed that the optimal enzyme solution for protoplast isolation was 1.5% cellulase R-10+0.5% macerozyme R-10+0.5 mol/L mannitol+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA.Fifth to sevevth true leaves,which were removed the lower epidermal layer with tape,were incubated in enzyme solution for 4 h at 25 ℃ in dark,and centrifugal speeds was 900 r/min for protoplast collection.The protoplast yield amounted to 6×106/g fresh weight and the vitality was up to 90%;Dual-luciferase reporter vector was used as the reporter gene and protoplasts were regarded as the receptor to measure protoplast transformation efficiency,when the concentration of PEG4000 was 20% and transfection time was 20 min in dark,the high luciferase activities of Photinus pyralis and Renilla reniformis could be detected,indicating that dual-luciferase reporter vector can be successfully loaded into protoplasts.The study provide technical basis for tartray buckwheat protoplast transient expression system and genetic manipulation.

Key words:tartary buckwheat;protoplast;isolation and purification;transient expression;dual-luciferase reporter vector

中圖分類號:Q781;Q785

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:張鐘仁(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事蛋白質(zhì)與酶學(xué)研究。E-mail:zhangzhongren08@126.com*通信作者:陳鵬,博士,教授,主要從事蛋白質(zhì)與酶等方面的研究。E-mail:pengchen@nwsuaf.edu.cn

基金項目:國家自然科學(xué)基金(30400282,31171606);西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2452015214)

收稿日期:2015-10-08;修改稿收到日期:2015-11-16

文章編號:1000-4025(2016)01-0183-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0183