熱休克蛋白27、60和90在胃癌中的表達(dá)及其臨床價(jià)值

周高見（中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410078）

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熱休克蛋白27、60和90在胃癌中的表達(dá)及其臨床價(jià)值

周高見
（中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410078）

摘要：目的探討熱休克蛋白（HSP-27）、HSP-60和HSP-90在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)66例胃癌組織HSP-27、HSP-60和HSP-90的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理特征、腫瘤增殖能力和患者生存期，分析3種熱休克蛋白（HSPs）表達(dá)的臨床意義。結(jié)果HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中異常高表達(dá)。HSP-27表達(dá)與腫瘤大小、器官轉(zhuǎn)移及病理分期相關(guān)，而HSP-27染色強(qiáng)度與淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。HSP-60表達(dá)與患者性別相關(guān)，而HSP-60染色強(qiáng)度與患者年齡和腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。HSP-90染色強(qiáng)度與腫瘤大小顯著相關(guān)（P=0.020）。單因素分析表明，HSP-90高表達(dá)與生存期更長(zhǎng)顯著相關(guān)，多因素分析證實(shí)HSP-90高表達(dá)是胃癌獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論HSP-27、HSP-60和HSP-90與具有治療胃癌療效評(píng)估價(jià)值的臨床病理參數(shù)相關(guān)。HSP-90高表達(dá)是胃癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：胃癌；熱休克蛋白；預(yù)后

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是在所有物種中廣泛存在、高度保守的蛋白，通常由熱休克、環(huán)境變化及生理病理壓力誘導(dǎo)引起，HSPs由幾種不同基因產(chǎn)物組成，通常根據(jù)其分子質(zhì)量命名[1]。HSPs的主要功能是作為分子伴侶，能夠維持其他多肽穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)移功能，熱休克蛋白的這一功能在保持正常細(xì)胞完整性和在惡性細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用十分重要。沒有外界壓力時(shí)，HSPs與熱休克轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，維持失活狀態(tài)[2]；壓力狀態(tài)下，HSPs抑制分子伴侶，與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)連接，通過蛋白激酶C和絲氨酸/酪氨酸激酶等蛋白激酶磷酸化使熱休克轉(zhuǎn)錄因子激活[3]。由此，熱休克轉(zhuǎn)錄因子在胞漿內(nèi)形成同源三聚體結(jié)構(gòu)，并與熱休克元素結(jié)合，激活熱休克誘導(dǎo)基因。

除了應(yīng)答熱休克、化學(xué)或物理因素刺激，HSPs在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌等多種人類腫瘤中過表達(dá)[4]。多種HSPs表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖和分化、多種類型腫瘤中凋亡相關(guān)分子調(diào)控密切相關(guān)。目前，已有數(shù)種針對(duì)HSPs的抗腫瘤藥物在進(jìn)行臨床前期實(shí)驗(yàn)。例如，靶向HSP-90藥物17AAG和SNX2112能夠選擇性抑制表達(dá)HSP-90的腫瘤細(xì)胞，而影響正常細(xì)胞功能[5]。

胃癌是中國(guó)及其他亞洲國(guó)家發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤。幽門螺旋桿菌感染和吸煙被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的環(huán)境因素。近來有研究表明，HSPs與胃腫瘤密切相關(guān)[6]。但是關(guān)于HSPs表達(dá)與胃癌治療和患者預(yù)后相關(guān)性的研究較為少見。

本研究主要評(píng)估胃癌組織中HSP-27、HSP-60 和HSP-90的表達(dá)，并探討其與胃癌患者臨床參數(shù)和生存期的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2007年1月-2008年12月于湘雅醫(yī)院普外科接受外科手術(shù)治療的66例原發(fā)性胃腺癌患者納入本研究。其中，男性47例，女性19例；年齡34～86歲，中位年齡56歲?；颊咝g(shù)前經(jīng)胃鏡活檢病理、CT或MRI檢查確診，臨床和病理資料完整。接受胃癌根治術(shù)者31例，接受非根治性手術(shù)者35例。同時(shí)選擇胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織作為對(duì)照組。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)

HSP-27、HSP-60和HSP-90抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)試劑[PV6000和二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液]購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用3％雙氧水H2O2。去離子水孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。微波抗原熱修復(fù)后，滴加一抗，置入4℃冰箱保存過夜。滴加二抗，37℃保溫箱孵育15 min。滴加DAB溶液顯色、復(fù)染、脫水、封片，光鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗為陰性對(duì)照，以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞，HSP-27、HSP-60和HSP-90陽(yáng)性部位在細(xì)胞漿。陽(yáng)性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)判斷按光鏡下觀察陽(yáng)性染色的細(xì)胞比例（5個(gè)高倍視野下的均數(shù)）：①染色細(xì)胞數(shù)<10％為陰性；②染色細(xì)胞數(shù)10％～50％為陽(yáng)性；③染色細(xì)胞數(shù)>50％為強(qiáng)陽(yáng)性。顯微攝像并用圖像分析儀進(jìn)行光密度值檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用單因素方差分析（One-way，ANOVA）HSP-27、HSP-60和HSP-90蛋白表達(dá)水平與性別、年齡、癌細(xì)胞分化程度及臨床分期等各臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性；對(duì)胃癌HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)進(jìn)行分層比較，用單因素和多因素分析研究各因素對(duì)預(yù)后的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果

HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌中的表達(dá)明顯高于正常組織。HSP-27、HSP-60和HSP-90典型免疫染色見圖1A～C。

2.2HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)的臨床意義

HSP-27表達(dá)平均值為52％，而在胃癌組織中HSP-27高表達(dá)（50％）。HSP-27的免疫染色強(qiáng)度分為輕度20例（30％）、中度40例（61％）及重度6例（9％）。HSP-27表達(dá)與腫瘤大小、器官轉(zhuǎn)移及病理分期相關(guān)（P=0.026、0.046和0.041）。HSP-27染色強(qiáng)度與淋巴結(jié)陽(yáng)性顯著相關(guān)（P=0.042）。見表1。

HSP-60表達(dá)平均值為52％，而在胃癌組織中HSP-60高表達(dá)（55％）。HSP-60免疫染色強(qiáng)度分為輕度21例（32％）、中度32例（48％）及重度13例（20％）。HSP-60表達(dá)與患者性別（P=0.011）相關(guān)。HSP-60染色強(qiáng)度與患者年齡及腫瘤組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)（P=0.027和0.031）。見表2。

圖1　HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中的表達(dá)（×200）

表1　66例胃癌患者HSP-27表達(dá)、染色強(qiáng)度和臨床病理特點(diǎn)　例（％）

表2　66例胃腺癌患者的HSP-90表達(dá)、染色強(qiáng)度和臨床病理特點(diǎn)　例（％）

續(xù)表1

HSP-90表達(dá)平均值為48％，而胃癌組織中HSP-90高表達(dá)（55％）。HSP-90免疫染色強(qiáng)度分為輕度30例（45％）、中度31例（47％）及重度5例（8％）。HSP-90表達(dá)與本研究所分析的臨床病理參數(shù)無關(guān)。HSP-90染色強(qiáng)度與腫瘤大小顯著相關(guān)（P= 0.020）。見表3。

表3　66例胃癌患者的HSP-90表達(dá)、染色強(qiáng)度和臨床病理特點(diǎn)　例（％）

2.3胃癌HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)的相關(guān)性

本研究采用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)評(píng)估HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明，HSP-27表達(dá)與HSP-60和HSP-90表達(dá)呈正相關(guān)（rs1=0.47，P1=0.000；rs2=0.32，P2=0.008），HSP-60和HSP-90表達(dá)程度也呈正相關(guān)（rs=0.25，P=0.044）。見表4。

表4　66例胃癌患者的HSP-27、HSP-60和HSP-90蛋白質(zhì)表達(dá)程度的斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)性

2.4胃癌中HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)的預(yù)后意義

Kaplan-Meier生存曲線分析表明，胃癌中HSP-27、HSP-60表達(dá)與患者總體生存期無關(guān)（P =0.478和 0.953），而單因素分析表明，HSP-90高表達(dá)與低表達(dá)胃癌患者生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）（見圖2A），多元回歸分析也證實(shí)HSP-90表達(dá)具有預(yù)后意義（P=0.026）。HSP-27、HSP-60和HSP-90免疫染色強(qiáng)度與患者生存率無關(guān)（P=0.577、0.094和0.299）。多元回歸分析還發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陰性胃癌患者（pN0）HSP-90高表達(dá)與生存率相關(guān)（P =0.042）（見圖2B）；高度及中度分化（G1/G2）胃癌患者HSP-90高表達(dá)與較長(zhǎng)整體生存時(shí)間顯著相關(guān)（P =0.036）（見圖2C）。未發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移的胃癌患者（pM0）HSP-90高表達(dá)與較長(zhǎng)生存時(shí)間顯著相關(guān)（P=0.027）（見圖2D），多因素分析證實(shí)HSP-90高表達(dá)是胃癌患者獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.032）。

圖2　HSP-90表達(dá)對(duì)胃癌患者生存期的影響

3　討論

HSPs在多種人類腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，本研究進(jìn)一步證實(shí)HSP-27、HSP-60和HSP-90表達(dá)在胃癌發(fā)展中的臨床意義。本研究結(jié)果表明，HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)。TAKANO[7]和KAPRANOS等[8]研究表明HSP-27的發(fā)生率分別為52.4％（22/42）和62.7％（54/86）。另外，HSP-70和HSP-40在胃癌中陽(yáng)性染色百分率分別為67.9％（55/81）和22.2％（18/81）。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HSP-27、HSP-60和HSP-90的陽(yáng)性表達(dá)率分別52％、52％和48％。一項(xiàng)僅含10例胃癌標(biāo)本的蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析表明，HSP-60、HSP-70及含TCP1伴侶蛋白亞基1（chaperonin containing TCP1，CCT）在胃癌組織中呈過表達(dá)，CCT屬于HSP-60家族成員。該研究表明，HSP-60、HSP-70和CCT過表達(dá)可能是由惡性轉(zhuǎn)化期間細(xì)胞的脅迫應(yīng)答和自我保護(hù)機(jī)制引起[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，HSP-27表達(dá)程度與HSP-60和HSP-90蛋白質(zhì)的表達(dá)程度呈正相關(guān)（斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)），并得出HSP-60與HSP-90的表達(dá)有較低的相關(guān)性（斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)）。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP-27表達(dá)及免疫染色強(qiáng)度與患者治療時(shí)重要臨床病理特征存在相關(guān)性。本結(jié)果與之前的一項(xiàng)證據(jù)一致，該研究在86例人類胃癌樣本中證實(shí)HSP-27表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HSP-27強(qiáng)度與免疫染色表達(dá)和淋巴腺狀態(tài)分別存在著顯著及邊界相關(guān)性。另外，HSP-27表達(dá)與器官轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)、腫瘤大小和病理分期顯著相關(guān)。然而，HSP-27表達(dá)和染色強(qiáng)度與患者生存不相關(guān)。Isomoto[10]和Maehara等[11]也都未發(fā)現(xiàn)HSP表達(dá)與患者生存的任何相關(guān)性。事實(shí)上，組織病理分化與HSP-70的表達(dá)顯著相關(guān)，然而HSP-70和HSP-40表達(dá)對(duì)任何推測(cè)預(yù)后及生存的因素都沒有影響。

HSP-60表達(dá)與患者性別顯著相關(guān)，而與Ki-67標(biāo)記指數(shù)反映的腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)和增殖能力僅有邊界相關(guān)性。事實(shí)上，女性患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的HSP-60表達(dá)要高于男性患者，而不良分化腫瘤中HSP-60的表達(dá)頻率則高于高度和中度分化腫瘤。另外，HSP-60的染色強(qiáng)度與患者年齡及腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。

根據(jù)本研究結(jié)果，HSP-90與臨床病理特征無關(guān)。然而，HSP-90免疫染色強(qiáng)度與腫瘤大小顯著相關(guān)，與病理組織學(xué)類型邊界相關(guān)?？傮w來說，已經(jīng)在幾種類型癌癥中對(duì)HSP-90表達(dá)值進(jìn)行檢測(cè)；關(guān)于胃癌，F(xiàn)landrin等[13]報(bào)告HSP-90α與淋巴轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。

目前，尚無關(guān)于胃癌中HSP-90表達(dá)預(yù)后價(jià)值的研究報(bào)道。本研究為檢查胃腺癌患者預(yù)后方面HSP-90表達(dá)的臨床意義的第一份報(bào)道。單因素生存分析中，較高的HSP-90蛋白質(zhì)表達(dá)與較長(zhǎng)的整體生存時(shí)間相關(guān)。另外，單因素生存分析顯示，HSP-90蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)于胃腺癌患者是一個(gè)重要并獨(dú)立的預(yù)后因素。在淋巴結(jié)陰性的不同臨床亞組中，高度和中度分化、器官轉(zhuǎn)移陰性和HSP-90高蛋白質(zhì)表達(dá)與預(yù)后良好相關(guān)。此外，HSP-90表達(dá)和免疫染色強(qiáng)度顯示出在腸型中與整體生存時(shí)間相關(guān)的趨勢(shì)，但該趨勢(shì)并不存在于彌漫型胃癌病例中。彌漫型和腸型胃癌患者之間對(duì)立的HSP-90過表達(dá)預(yù)后值可以歸因于腫瘤微環(huán)境和每個(gè)腫瘤病理組織學(xué)類型的個(gè)體細(xì)胞特點(diǎn)所產(chǎn)生的不同信號(hào)。這樣明顯的不同能夠觸發(fā)腫瘤樣細(xì)胞來上調(diào)或下調(diào)與腫瘤病理組織學(xué)類型相關(guān)的HSP-90信號(hào)?？傊?，HSP-27、HSP-60和HSP-90與部分胃癌臨床病理參數(shù)有關(guān)，該參數(shù)對(duì)評(píng)估胃腺癌患者的療效具有重要價(jià)值。HSP-90高表達(dá)是胃腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

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（申海菊編輯）

Expression of HSP-27, 60 and 90 in gastric cancer and its clinical significance

Gao-jian Zhou
(Reproductive and Genetic Hospital of China International Trust and Investment Company-Xiangya, Changsha, Hunan 410078, China)

Abstract:Objetives To evaluate the clinical significance of heat shock protein (HSP)-27, HSP-60 and HSP-90 expression in gastric carcinoma.Methods HSP-27, HSP-60 and HSP-90 expression was assessed immunohistochemically in tumoral samples of 66 gastric adenocarcinoma patients and was statistically analyzed in relation to various clinicopathological characteristics, tumor proliferative capacity and patients' survival.Results HSP-27, HSP-60, HSP-90 were abundantly expressed in the gastric adenocarcinoma tissues.HSP-27 expression was significantly associated with tumor size, the presence of organ metastases and pathological stage, while HSP-27 staining intensity was significantly correlated with nodal status.HSP-60 expression was significantly correlated with patients' sex, while HSP -60 staining intensity with patients' age and tumor histopathological grade.HSP-90 expression was not associated with any of the clinicopathological parameters examined; however, HSP-90 staining intensity was significantly associated with tumor size.High HSP-90 expression was significantly associated with longer overall survival time in univariate analysis, and was also identified as an independent prognostic factor in multivariate analysis.Conclusions HSP-27, HSP-60 and HSP-90 are correlated with certain clinicopathological parameters which are crucial for the management of gastric adenocarcinoma patients.HSP-90 expression may also be an independent prognostic indicator in gastric adenocarcinoma patients.

Keywords:gastric cancr; heat shock protein; prognosis

收稿日期：2015-10-16

文章編號(hào)：1005-8982（2016）01-0069-07

中圖分類號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A