豬呼腸孤病毒的特征及檢測技術研究進展

文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國 李 峰 姚春陽 馬 力

豬呼腸孤病毒的特征及檢測技術研究進展

文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國 李 峰 姚春陽 馬 力

仔豬病毒性腹瀉一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要因素。豬呼腸孤病毒(Porcine reovirus，PRV)屬呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，是仔豬病毒性腹瀉的主要原因之一。PRV在豬群中廣泛存在，對豬具有一定的致病性。另外，健康豬群體內也會存在PRV。PRV感染未吃初乳的初生仔豬會引起豬的體溫升高以及腹瀉等癥狀。由于PRV感染豬的致病機制尚不明確，因此目前還沒有特異性的預防和治療該疾病的方法。本文概括了PRV的病毒特征及檢測技術，以期對疾病的預防和控制提供參考。

1 病毒的由來和發(fā)現(xiàn)

目前報道的豬呼腸孤病毒共有3個血清型，其中I型由Kasza等(1970)和McFerran等(1970)分別分離報道；Ⅲ型由Robl等(1971)分離報道；Ⅱ型由Fukutomi等(1996)在日本首次分離報道。曾志勇等(2006)在國內首次從豬體內分離得到了Ⅲ型哺乳動物呼腸孤病毒SC-A株，隨后，Zhang等(2007)也分離得到一株Ⅲ型的哺乳動物呼腸孤病毒MRV-HLJ/2007株，Kwon等(2011)從韓國78個豬場237份腹瀉樣品中檢出了45份Ⅲ型哺乳動物呼腸孤病毒陽性(檢出率達19%)，并且從陽性病料中分離得到10株Ⅲ型哺乳動物呼腸孤病毒。從患有呼吸道疾病或胃腸道疾病的豬、臨床健康的豬、流產胎兒等都可分離得到呼腸孤病毒。實驗接種有時不會發(fā)病。

2 病毒的分類地位

豬呼腸孤病毒為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒。已知呼腸孤病毒科(Reoviriche)是一個龐大的病毒科，有9個既定屬和2個擬定屬，能廣泛地侵染自然界中各種生物有機體，并可導致機體產生各種病理反應。其中，哺乳動物呼腸孤病毒(Mammalian Reovirus，MRV)，主要感染人和哺乳動物（如豬、牛、馬、犬、貓、鼠等）的呼吸道或消化道，對動物具有廣泛的致病性。豬呼腸孤病毒是MRV的一種，無囊膜，具有特征性的20面體對稱雙層衣殼結構。完整的病毒粒子直徑為76nm左右，核心的直徑約52nm。

3 流行病學特點

呼腸孤病毒是一類既能感染呼吸道，又能感染胃腸道的病毒，豬群中流行普遍。幾乎所有的豬都可檢測到3種血清型的抗體。病毒經口感染或經呼吸道感染。被動抗體在新生仔豬體內可存在11周左右，之后任何年齡的豬對呼腸孤病毒均有易感性。

4 臨床癥狀

呼腸孤病毒在接種24h后由鼻腔分泌物和糞便排出，可持續(xù)6～14d。通常斷奶仔豬鼻內接種或接觸由氣溶膠傳播的I型呼腸孤病毒，表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，主要特征是發(fā)熱、打噴嚏、食欲不振、精神沉郁等。呼腸孤病毒Ⅲ型經靜脈或肌肉注射血清呈陰性的，若40～85d的經產母豬感染，可導致木乃伊胎、死胎、弱胎等?？蓮慕洰a母豬的流產排泄物和胎盤中分離得到病毒。

5 病理變化

所有豬呼腸孤病毒的動物試驗均表明其不會導致受感染仔豬產生明顯的臨床癥狀，但可對肺臟或腸上皮細胞產生輕微損傷。呼腸孤病毒接種的研究表明，感染后很少有全身性病理變化，一般只顯示輕微的顯微病理變化。I型呼腸孤病毒以氣溶膠的形式感染4周齡的SPF仔豬，不會導致全身性病理變化，但可引起一致的肺部顯微病變——淋巴細胞和巨噬細胞在肺泡和肺泡間隔多灶性集聚，及支氣管淋巴細胞肥大性增生。70kg的SPF豬經鼻內接種呼吸道分離的Ⅲ型呼腸孤病毒，可導致肺泡性肺氣腫、支氣管結節(jié)狀淋巴細胞肥大性增生，各肺小葉之間程度不同。

6 病毒的致病機制

豬呼腸孤病毒在豬群中廣泛存在，對豬具有一定的致病性。豬呼腸孤病毒感染初生仔豬后，可能會引起仔豬的體溫瞬間升高、腹瀉，甚至是肺部的纖維化。而有些仔豬感染后，僅表現(xiàn)出亞臨床經過，但還能從仔豬糞樣中再次檢測到病毒。呼腸孤病毒主要是在自然感染豬的呼吸道和腸道中復制。呼腸孤病毒的致病機理和病理變化目前主要是用小鼠來研究，所取得的進展對于病毒及病毒與宿主間的作用很有意義。小鼠感染呼腸孤病毒后可引起心肌炎，這與呼腸孤病毒侵入后可引起無明顯炎癥反應的心肌細胞損傷有關。盡管豬呼腸孤病毒是否造成仔豬腹瀉與諸多因素有關，但因其與人呼腸孤病毒同屬MRV，不能排除人畜共患的可能，故需謹慎對待呼腸孤病毒，應對呼腸孤病毒與動物和人類疾病的關系等作進一步研究。

7 病毒的檢測技術研究進展

目前已知的豬呼腸孤病毒所致的臨床癥狀和病理變化都不具有特征性，因此，該病的診斷有賴于實驗室檢測。

7.1 病毒分離與鑒定

雖然該病毒存在于病豬糞樣、呼吸道分泌物、肺、脾等組織中，但發(fā)病后8～12h內的糞和呼吸道分泌物的檢出率最高，而糞便是樣品采集的首選。該病毒對多種細胞系以及多種原代細胞都能適應，并產生細胞病變(CPE)。哺乳動物的血清均可能含有抗呼腸孤病毒的抗體，分離前要除去。曾志勇等(2008)通過在病毒培養(yǎng)液中添加胰酶的方法，用Vero細胞進行病原分離，結果分離到1株能在該細胞上穩(wěn)定產生明顯CPE，即以細胞顆粒增多、腫脹、漂落為特征的分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，經系列鑒定后證實為豬呼腸孤病毒，并命名為豬呼腸孤病毒SC-A株。何小明(2013)通過在細胞培養(yǎng)液中添加胰酶的方法，從仔豬腹瀉糞樣中分離到豬源I型呼腸孤病毒SHR-A株。呼腸孤病毒可通過兩種途經感染細胞：①通過病毒粒子吸附于細胞表面的受體分子，在受體介導的胞吞作用下侵入細胞，并借助溶酶體中一些蛋白酶降解其外衣殼，生成具有感染性的次病毒顆粒(ISVP)；②部分病毒粒子在胞外經蛋白酶降解生成的ISVP后直接侵入細胞，此時則不依賴于受體介導的胞吞作用?？赡苷且驗樵诓《九囵B(yǎng)液中添加了胰蛋白酶，從而減少了病毒對細胞及其受體的依賴，并最終成功分離得到病毒株。

7.2 血清學方法

7.2.1 血凝抑制試驗(HI) Ⅰ型和Ⅱ型豬呼腸孤病毒均有凝集人紅細胞的顯著特性，Ⅲ型呼腸孤病毒能凝集牛紅細胞，并比凝集人紅細胞的滴度高。這2種動物的紅細胞是該病毒血凝試驗的主要材料。另外，該病毒能凝集豬紅細胞，不能凝集豚鼠和雞紅細胞。該病毒的凝集作用可被同型血清有效抑制。因此，一般用血凝抑制試驗鑒定其血清型別。

7.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 中國廣東分離株GD-1屬于血清Ⅲ型，該病毒含有10條分節(jié)段基因，其中編碼σ1蛋白的為Sl基因。研究表明，σ1蛋白是一種細胞的吸附蛋白，也是一種血凝素，雖然其僅占病毒顆粒的比重為2%，但它是引起特異性的抗病毒免疫反應作用的關鍵蛋白，能夠介導病毒與細胞受體的結合，與特異性的血清型抗體相結合，因而可以應用于抗體的檢測。劉啟亮等(2016)采用PCR方法擴增PRV GD-1株S1基因，并以原核系統(tǒng)表達其編碼的σ1蛋白。以純化的σ1蛋白作為包被抗原，鵝抗豬IgG-HRP為檢測抗體，建立了PRV血清型Ⅲ型間接ELISA血清學的檢測方法。應用該法和同類ELISA進口抗體檢測試劑盒對606份臨床樣品進行檢測，兩者符合率為96.2%。該方法的建立為進一步開發(fā)商品化試劑盒奠定了基礎。

7.3 分子生物學方法

PCR具有快速、敏感、特異等優(yōu)點，已被廣泛應用于PRV的實驗室檢測。2011年底以來，我國很多省市初生仔豬出現(xiàn)腹瀉性疾病。病豬以腹瀉、脫水、厭食、迅速消瘦為主要特征。一些研究結果顯示，其主要病原包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒和博卡病毒等。為了進一步研究該類疾病的病原流行毒株特性，陳興慧等(2012)研究采用上述31個規(guī)模豬場102份腹瀉病料樣品，應用RT-PCR檢測PRV，結果REOV的豬場陽性率為45.16%，病料樣品陽性率為26.47%。選擇2份病料無菌處理后接種Vero細胞，維持液中添加5μg/mL胰酶，傳代2～3次，出現(xiàn)CPE，經過RT-PCR擴增和基因序列分析，病毒粒子負染電鏡觀察，證明其為PRV，命名為ZJ120101和AH120411毒株。談晨(2013)通過RT-PCR方法從仔豬腹瀉病料中檢測出PEDV和PRV，PEDV豬場陽性率67.74%，病料樣品陽性率46.08%，PRV的豬場陽性率為45.16%，病料樣品陽性率為26.47%，豐富了我國仔豬腹瀉病原流行病學資料。何小明(2013)用套式RT-PCR檢測2010年1月～2012年12月送檢的不同豬場病料，并對其中45份陽性病料的核酸進行濃縮后用根據S1基因設計的型特異性的引物進行RT-PCR，同時將擴增產物純化并克隆至T載體經測序后進行進化分析。進化分析結果表明這些毒株分屬血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅲ型毒株為優(yōu)勢流行毒株，流行范圍覆蓋大陸絕大部分地區(qū)。另外，其他分子生物學檢測技術，如熒光定量RT-PCR、核酸探針技術及核酸的PAGE電泳鑒定等也被相繼應用于豬呼腸孤病毒的檢測。這些技術的應用為新的檢測方法的建立、流行病學監(jiān)測以及有效的防控措施制定提供了理論基礎?！?/p>

略）

山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬產業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-08-17)；山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF121027)。