水稻條紋葉枯病病毒檢測技術(shù)及應(yīng)用前景研究

陳麗君 馬玉玲 包 蔚 何 鍇 李念文 （上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 201800）

水稻條紋葉枯病病毒檢測技術(shù)及應(yīng)用前景研究

陳麗君 馬玉玲 包 蔚 何 鍇 李念文 （上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 201800）

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱傳播引起的病毒病，其病原是條紋葉枯病毒，為有效防治水稻條紋葉枯病，亟需加強對條紋葉枯病毒的了解?，F(xiàn)對水稻條紋葉枯病病毒的檢測技術(shù)和應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述，包括間接ELISA法、斑點免疫結(jié)合(DIBA)法、RT-PCR技術(shù)和熒光定量RT-PCR技術(shù)等。

水稻條紋葉枯病病毒；檢測技術(shù)；應(yīng)用前景

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱傳播引起的水稻病毒病，有“水稻癌癥”之稱，該病廣泛分布于日本、中國、韓國和南美等國家和地區(qū)[1]。水稻條紋葉枯病最早于1897年發(fā)現(xiàn)于日本關(guān)東地區(qū)，我國最早于1964年發(fā)現(xiàn)該病。近幾年，隨著氣候環(huán)境的變化和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，國內(nèi)水稻條紋葉枯病發(fā)病規(guī)模有不斷擴大的趨勢，目前，該病在我國16個省、市、自治區(qū)均有分布，其中以江蘇、云南等地發(fā)生最為嚴(yán)重[2]。由于灰飛虱為水稻條紋葉枯病的主要傳播媒介，屬循回、增殖型傳播，一旦染毒可持久性傳播，并由雌蟲經(jīng)卵傳播給下一代幼蟲，因此，該病的發(fā)生與灰飛虱越冬蟲量、蟲口帶毒率有很大關(guān)系。根據(jù)近幾年的田間調(diào)查情況，由于灰飛虱越冬代蟲源基數(shù)高、一代蟲源發(fā)生量高及帶毒率高、存活率高、綠肥種植面積增加、水稻播種期提前等因素，導(dǎo)致水稻條紋葉枯病在水稻上已普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了當(dāng)前的水稻生產(chǎn)[3]。水稻條紋葉枯病的病原是條紋葉枯病毒（RSV），且為單鏈的RNA病毒，屬纖細(xì)病毒屬。和大部分RNA病毒一樣，RSV有廣泛的變異[4]，不同地區(qū)病株上的分離物在致病性、核酸序列等方面存在一定的差異。為有效防治該病，亟需加強對該病毒的了解，為此，筆者對水稻條紋葉枯病病毒的檢測技術(shù)和應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述，以供參考。

1 檢測技術(shù)

1.1 間接ELISA法

陳光育等[5]對間接ELISA法的具體檢測步驟進(jìn)行了描述，具體為：在普通多孔聚酯板上用100μL樣品包被，4 ℃過夜或37 ℃ 2 h；加2%牛血清封閉液封閉，37 ℃ 0.5 h后，加入100μL單抗（用封閉液稀釋40 000倍）37 ℃ 1 h；每孔用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(封閉液稀釋5 000倍)孵育37 ℃ 1 h；底物液37 ℃顯色0.5 h；加50μL 2 moL/L硫酸終止反應(yīng)。每步用PBST洗滌3次，每次3 min。

1.2 斑點免疫結(jié)合(DIBA)法

周益軍等[5]對斑點免疫結(jié)合(DIBA)法的具體檢測步驟進(jìn)行了描述，具體為：在雜交膜上劃0.5 cm×0.5 cm方格，每格加入3μL樣品室溫晾干；加4%牛血清(或0.4%BSA)封閉37 ℃ 0.5 h后，浸入單抗(封閉液稀釋10 000倍)中37℃ 1.5 h；用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(封閉液稀釋5 000倍)孵育37 ℃ 1.5 h；洗滌后浸入固體顯色底物液中，37 ℃ 0.5 h。每步用PBST洗滌3次，每次3 min。

1.3 RT-PCR技術(shù)

嵇朝球等[7]根據(jù)水稻條紋葉枯病病毒基因組序列的信息，通過在其外殼蛋白基因和毒蛋白基因的兩側(cè)設(shè)計兩對引物，對提取的總RNA進(jìn)行了RT-PCR擴增，擴增出水稻條紋葉枯病病毒基因組特有的2個條帶，并通過測序和Genbank blast獲得證實。

1.4 熒光定量RT-PCR技術(shù)

楊金廣等[8]對Genbank中已有的水稻條紋葉枯病病毒CP基因進(jìn)行了分析比較，選擇CP最保守區(qū)域設(shè)計高特異性的引物，應(yīng)用基于SYBR Green染料法的熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。

2 應(yīng)用前景

針對前4種檢測技術(shù)，目前在生產(chǎn)中應(yīng)用較廣泛的是利用間接ELISA法和斑點免疫結(jié)合(DIBA)法來檢測灰飛虱帶毒率，進(jìn)而對條紋葉枯病發(fā)生情況進(jìn)行預(yù)測預(yù)報。這兩種方法不僅擁有較高的準(zhǔn)確性，同時還具有操作簡便、快速和試驗用具要求低等優(yōu)點，適合在基層植保工作中推廣使用。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RT-PCR技術(shù)得到了迅速而廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)可有效檢測灰飛虱體內(nèi)的病毒，進(jìn)而測定灰飛虱群體的帶毒率。與免疫法相比，該技術(shù)具有快速、靈敏和特異性強的優(yōu)點，且不需要制備抗血清，適于普及應(yīng)用。值得一提的是，該技術(shù)突破了僅可對灰飛虱蟲體檢測的局限，可對其主要的越冬寄主植物和水稻植株的病毒同時進(jìn)行病毒檢測，這是條紋葉枯病檢測技術(shù)的一大突破，對于開展水稻條紋葉枯病的預(yù)測預(yù)報具有非常重要的現(xiàn)實意義。

熒光定量RT-PCR技術(shù)技術(shù)可快速、靈敏、準(zhǔn)確地鑒定出2種及其以上品種的抗性差異，這為抗病品種鑒定和抗性種質(zhì)資源的篩選提供了可靠的工具，該方法更適用于科學(xué)研究。

[1] 林奇英,謝聯(lián)輝,周仲駒,等.水稻條紋葉枯病的研究.I.病害的分布和損失[J].福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1990,19(4)：421-425.

[2] 魏太云.水稻條紋病毒的基因組結(jié)構(gòu)及其分子群體遺傳[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2003.

[3] 蔣耀培,李建剛,譚秀芳,等.上海地區(qū)水稻條紋葉枯病的發(fā)生與防治技術(shù)初探[J].上海農(nóng)業(yè)科技,2005(5):37-38.

[4] 劉力,陳聲祥,陳光堉,等.我國水稻條紋葉枯病病原性質(zhì)的研究[J].病毒學(xué)雜志,1990(3):306-311.

[5] 陳光堉.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測水稻條紋葉枯病介體昆蟲帶毒率[J].植物保護(hù)學(xué)報,1984(2）：73-78.

[6] 周益軍,劉海建,王貴珍,等.灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒免疫檢測[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1）：50-51.

[7] 嵇朝球,鐘環(huán),鐘佩英,等.水稻條紋葉枯病病毒RT-PCR快速檢測研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）,2005,23(2）：188-191.

2016-05-13