■劉亦娟孫金生，2包海巖張　勤臧　莉徐曉麗

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300221；3.天津市水產(chǎn)技術推廣站，天津300221）

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魚類病原菌三聯(lián)體檢測試紙的制作與應用

■劉亦娟1孫金生1，2包海巖3張勤3臧莉3徐曉麗3

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300221；3.天津市水產(chǎn)技術推廣站，天津300221）

摘要：試驗分別制作柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌3種病原菌的膠體金免疫層析試紙條，將其組裝成三聯(lián)體卡條，用于3種常見魚類病原菌的平行檢測。結(jié)果表明，所制作的三聯(lián)體檢測試紙具有較好的特異性，與其它魚類病原菌無交叉反應，對柱狀黃桿菌的檢測靈敏度為3×106cfu/ml，對嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌的檢測靈敏度均為3×105cfu/ml。將三聯(lián)體檢測試紙用于生產(chǎn)上魚類病原菌的現(xiàn)場檢測，與實驗室檢測結(jié)果的符合率在87.7%以上。操作簡便快速，一次制樣可同時檢測3種病原菌，5~ 10 min即可得到檢測結(jié)果，提高了檢測效率，適合基層生產(chǎn)推廣應用及大量樣本的快速篩查。

關鍵詞：柱狀黃桿菌；嗜水氣單胞菌；海豚鏈球菌；免疫層析試紙條；三聯(lián)體檢測試紙

細菌性疾病是魚類養(yǎng)殖過程中的最常見也是危害最大的一類疾病，病原菌種類較多，危害嚴重，如由柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)引起的細菌性爛鰓病、由嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）引起的細菌性敗血癥以及由鏈球菌引起的鏈球菌病，一旦發(fā)生，可在短期內(nèi)造成很高的水生動物死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。對于魚類細菌病的防治，使用抗生素仍是目前生產(chǎn)中使用的主要手段，但治療效果并不理想，不僅提高了養(yǎng)殖成本，還帶來一系列的負面影響。因此應對魚類細菌病，日常消毒、早期預防以及有效的檢測診斷、對癥施治尤為重要。對細菌病的檢測診斷，實驗室多采用細菌分離鑒定法及PCR法來對病原菌做準確的鑒定，并通過藥敏分析篩選敏感藥物指導生產(chǎn)，針對性較好，但耗時長，需要專業(yè)的實驗室及操作人員。養(yǎng)殖生產(chǎn)中則主要依靠技術人員的經(jīng)驗，具體病原菌并不十分確切，用藥存在盲目性，且多數(shù)細菌性疾病為多種病原菌混合感染導致，不同細菌對藥物的敏感性不同，所使用的藥物與治療方法也不盡相同。養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟需一種適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場的魚類細菌性病原菌的快速、準確、簡便的檢測技術，以及早確定病原菌，采取有效措施控制病害發(fā)生，為養(yǎng)殖生產(chǎn)提供技術支撐。

膠體金免疫層析試紙是20世紀末發(fā)展起來的一種新型的體外診斷技術產(chǎn)品，具簡便快速、靈敏準確等優(yōu)點，不需要專業(yè)儀器設備，操作簡單，適用于現(xiàn)場檢測。目前，膠體金免疫層析試紙在醫(yī)學及畜牧疾病檢測領域已有較多的應用，如檢測乙肝病毒、豬鏈球菌Ⅱ型、金黃色葡萄球菌、H5、H9亞型禽流感病毒、犬弓形蟲等的試紙條[1-4]。在水產(chǎn)病原菌生物檢測領域，已分別建立了用于檢測溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、對蝦白斑病病毒[5-9]等的免疫層析試紙條，均針對于某一種病原菌進行檢測。本研究制作了柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌的免疫層析試紙條，并將其組裝成三聯(lián)檢測試紙，用于3種魚類病原菌的同時檢測，提高了檢測效率，適用于大量樣本的現(xiàn)場篩查，也為水產(chǎn)動物疾病的系統(tǒng)診斷提供參考。

1　材料

1.1儀器與試劑

18~20 nm膠體金溶液、硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維、吸水紙、PVC板均購自上海杰一生物技術有限公司；羊抗兔IgG購自北京康為世紀公司；牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、蔗糖購自生工生物工程股份有限公司；單維往復劃膜儀購自上海金標公司，細菌比濁儀購自法國梅里埃公司，離心機購自Sigma公司。

1.2菌株來源

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、柱狀黃桿菌、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)、魚腸道弧菌(Vibrio ichthyoenteri）、鰤魚諾卡氏菌（Nocardia serio?lae）、無乳鏈球菌（S. agalactiae）、鰻利斯頓氏菌（Lis?tonella anguillarum）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella starda）、哈維氏弧菌（V.harveyi）由本實驗室分離并保存，類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）、弗尼斯弧菌（V.furnissii）、維氏氣單胞（A.veronii）、嗜水氣單胞菌由天津市水生動物疫病預防控制中心提供。

2試驗方法

2.1細菌抗體的制備

取海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌分別免疫新西蘭白兔，得到兔抗海豚鏈球菌、兔抗柱狀黃桿菌、兔抗嗜水氣單胞菌3種抗血清，采用Protein A親和層析法純化所得到的抗血清，間接ELISA方法測定抗體效價，-80℃保存。

2.2金標抗體的制作

2.2.1最適標記pH值的確定

用0.01 mol/l K2CO3將膠體金溶液調(diào)至6.0~10.0不同的pH值梯度。取不同pH值的膠體金溶液各1 ml，分別加入抗海豚鏈球菌抗體（抗柱狀黃桿菌抗體或抗嗜水氣單胞菌抗體）10 μg，振蕩混勻后靜置30 min，加入100 μl 10%的NaCl溶液混勻靜置4 h，觀察每管顏色變化，以顏色保持不變的pH點作為最佳標記pH值。

2.2.2最適標記蛋白量的確定

用0.01 mol/l K2CO3將膠體金溶液調(diào)至最適pH值，取6支EP管，每管各加入膠體金溶液1.0 ml，每管分別再加入1、5、10、15、20、25 μg的抗海豚鏈球菌抗體（抗柱狀黃桿菌抗體或抗嗜水氣單胞抗體）使其形成不同濃度梯度，混勻后靜置30 min，加入100 μl 10%的NaCl溶液混勻靜置4 h，觀察每管顏色變化，將顏色變化最小一組的抗體標記濃度作為最佳標記濃度，工作濃度則選擇最佳標記濃度高一個級別的濃度。

2.2.3金標抗體的制備與純化

將膠體金溶液調(diào)至最適標記pH值，加入最適標記濃度的待標記抗體，混勻后靜置；加入5%的BSA使其加入后終濃度為1%，混勻，將初步制得的金標抗體溶液4 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液于13 500 r/min、4℃離心30 min棄上清，沉淀用金標抗體洗滌液（含1% BSA的PBS）洗滌2次后，用金標抗體保存液（含1% BSA，2%蔗糖，0.1% Tween-20的PBS）重懸保存于4℃。

2.3膠體金墊的制備

將純化后的金標抗體均勻噴涂在玻璃纖維膜上，37℃干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 NC膜檢測層的制備

用pH值7.4的0.01 mol/l PBS分別將羊抗兔IgG的濃度稀釋為1、2 mg/ml，將細菌抗體分別稀釋為3、2.5、2、1.5、1、0.5 mg/ml。然后設置膠體金三維噴點平臺參數(shù)，在NC膜上分別噴涂1、2 mg/ml的羊抗兔IgG作為質(zhì)控線（C線），在此基礎上分別噴涂6個不同濃度的抗海豚鏈球菌抗體（柱狀黃桿菌多克隆抗體或嗜水氣單胞菌抗體）作為檢測線（T線），形成12個不同的組合。將包被有抗體的NC膜室溫干燥后完全浸潤到1% BSA（由0.01 mol/ml PBS配制）中封閉1 h，取出洗滌3次，干燥后，組裝成試紙條。以純培養(yǎng)的海豚鏈球菌菌液（柱狀黃桿菌或嗜水氣單胞菌）測試，觀察質(zhì)控線和檢測線的顯色情況，確定質(zhì)控線和檢測線處包被抗體的最適濃度。

2.5試紙條的組裝

將已包被抗體的NC膜檢測層依次與吸水紙、膠體金墊、玻璃纖維固定于不干膠底板上組裝，用裁條機將其裁切成4 mm寬的試紙條，切好的試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋中密封保存于4℃。

2.6 3種試紙條靈敏度的測定

分別調(diào)整純培養(yǎng)的3種細菌菌液濃度為3×108~ 3×102cfu/ml，PBS作為陰性對照，取相應的試紙條進行檢測，觀察顯色結(jié)果；再將檢測后的試紙條的NC膜檢測層剪下，用0.05 mol/l的檸檬酸鹽緩沖液(pH值3.8)洗滌平衡5 min后，放入銀染液中，避光20 min，觀察銀染結(jié)果，以肉眼能夠觀察到的檢測線出現(xiàn)條帶的最低可測試量作為試紙條的靈敏度。

2.7 3種試紙條特異性的測定

取1.2節(jié)中所提到的細菌均調(diào)整細菌菌液濃度至3×108cfu/ml，以PBS作為陰性對照，測試3種試紙條的特異性。

2.8三聯(lián)體卡條的組裝及應用

將制作好的3種檢測試紙裁成6 mm×3 mm的大小封入三聯(lián)卡槽中，即成魚類病原菌三聯(lián)現(xiàn)場檢測試紙。使用時取待檢病魚病灶處組織(體表潰爛處、肝、腎、腹水等，5 mg)加0.5 ml PBS研磨，靜置取上清液作為待檢液，分別取0.1 ml待檢液加入魚類病原菌三聯(lián)現(xiàn)場檢測試紙的三個加樣孔中，靜置，10 min內(nèi)觀察結(jié)果。若某一結(jié)果觀察窗的T線和C線均出現(xiàn)紅線，顯示對應的菌的檢測結(jié)果為陽性；僅C線出現(xiàn)紅線顯示結(jié)果為陰性；僅T線出現(xiàn)紅線而C線未出現(xiàn)紅線或者二者均不出現(xiàn)紅線顯示試紙條無效。若2個及以上的細菌檢測結(jié)果為陽性，顯示結(jié)果為多種菌的混合感染。

三聯(lián)體卡條檢測結(jié)果的驗證：嗜水氣單胞菌的檢測結(jié)果采用RS培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng)、PCR擴增嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶（AHP）基因[10]、結(jié)合病魚癥狀進行驗證；海豚鏈球菌的檢測結(jié)果采用細菌分離培養(yǎng)、PCR擴增該菌16S rRNA的保守區(qū)域[11]、結(jié)合病魚癥狀進行驗證；柱狀黃桿菌的檢測結(jié)果采取選擇性培養(yǎng)基進行細菌分離（含1% Tobramycin的shieh培養(yǎng)基分離）結(jié)合病魚癥狀、顯微鏡鏡檢進行驗證。

3　結(jié)果

3.1金標抗體的最適標記條件

3.1.1最佳標記

pH值以抗海豚鏈球菌抗體的膠體金標記結(jié)果為例（見圖1）。加入等量的抗體，1號管內(nèi)的顏色變藍，2~5號管的pH值保持均一紅色。因此，選擇海豚鏈球菌金標抗體的最適標記pH值為7.0。同樣方法得出，嗜水氣單胞菌金標抗體的最適標記pH值為7.0，柱狀黃桿菌金標抗體的最適標記pH值為8.0（見表1）。

圖1海豚鏈球菌金標抗體標記最適pH值

3.1.2最佳標記蛋白量

調(diào)整膠體金的pH值為7.0，加入不等量的抗體(結(jié)果見圖2)。1號和2號管均變藍，說明蛋白的加入量過少；3~6管內(nèi)的顏色保持不變，選擇顏色保持不變的抗體標記量為最佳標記量，工作濃度選擇比最佳標記濃度高一個級別的濃度點，因此選擇10 μg/ml作為海豚鏈球菌金標抗體的最佳標記量。同樣方法得出，嗜水氣單胞菌金標抗體的最佳標記量為15 μg/ml，柱狀黃桿菌金標抗體的最佳標記量為15 μg/ml(見表1)。

圖2海豚鏈球菌金標抗體最佳抗體標記量

3.2檢測線和質(zhì)控線最適包被濃度

NC膜檢測層上檢測線和質(zhì)控線處抗體的包被濃度直接影響檢測結(jié)果。以海豚鏈球菌免疫層析試紙條為例，試驗結(jié)果顯示，在NC膜檢測層的檢測線處包被濃度為1.5 mg/ml或2 mg/ml的抗海豚鏈球菌抗體，檢測線顯色結(jié)果較好，低于1.5 mg/ml檢測線顯色變淺，質(zhì)控線濃度為1 mg/ml或2 mg/ml顯色效果無明顯變化(見表2)。因此，最終選擇檢測線上包被1.5 mg/ml的抗海豚鏈球菌抗體，質(zhì)控線上包被1 mg/ml的羊抗兔IgG。同樣方法測得嗜水氣單胞菌和柱狀黃桿菌試紙條檢測線和質(zhì)控線處所包被的相應抗體的最適包被濃度(見表3)。

表1膠體金標記的最適條件

表2檢測線和質(zhì)控線最適包被濃度

表3檢測線和質(zhì)控線最適包被濃度(mg/ml)

3.3 3種試紙條的靈敏度分析

以最適標記條件制作金標抗體及膠體金墊，以最適濃度抗體包被制作NC膜檢測層，組裝成試紙條，采用10倍比稀釋的對應菌液測試所制作試紙條的靈敏度，以試紙條所能檢測菌液的最低限度作為該試紙條的靈敏度，結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌試紙條的檢測靈敏度均為3×105cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測信號后靈敏度為3×104cfu/ml；柱狀黃桿菌的靈敏度稍低，為3×106cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測信號后靈敏度為3×105cfu/ml。

3.4 3種試紙條的特異性分析

以1.2中所列細菌檢測3種試紙條的特異性，結(jié)果顯示柱狀黃桿菌試紙條僅對柱狀黃桿菌菌液的檢測結(jié)果為陽性，對另外12種菌液的檢測結(jié)果為陰性；嗜水氣單胞菌試紙條僅對嗜水氣單胞菌的檢測結(jié)果為陽性，對另外12種菌液的檢測結(jié)果為陰性；海豚鏈球菌試紙條僅對海豚鏈球菌的檢測結(jié)果為陽性，對另外12種菌液的檢測結(jié)果為陰性；所制備的3種試紙條具有良好的特異性。

3.5三聯(lián)體卡條的應用

挑選瀕死且癥狀明顯的魚進行疾病診察，疑為細菌病的病魚，取肝臟、脾臟、腹水、腎臟組織或其它病變部位，研磨后取上清采用三聯(lián)體卡條進行檢測。試驗共收集疑為細菌病的病魚122例，其中檢出嗜水氣單胞菌陽性樣品41個，實驗室確診陽性樣品50個，符合率為92.6%，海豚鏈球菌陽性樣品20個，實驗室確診陽性樣品32個，符合率為90.2%，柱狀黃桿菌陽性樣品16個，實驗室確診陽性樣品31個，符合率為87.7%。以上結(jié)果證實，制備的試紙條具有較高的準確性。部分檢測結(jié)果如圖3所示。

4　討論

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的各種暴發(fā)性病害時有發(fā)生，危害也日益嚴重，每年由病害所致的直接經(jīng)濟損失至少為數(shù)百億元以上。細菌性疾病是其中危害最為廣泛的一類疾病，病原種類繁多，傳播擴散快，發(fā)病情況復雜，多為多種病原混合感染，病原菌環(huán)境適應能力強，對抗菌素易產(chǎn)生耐藥性，病害一旦發(fā)生，很難控制?，F(xiàn)有檢測技術試劑盒產(chǎn)品多針對于一種病原進行檢測，效率較低，實驗室檢測可系統(tǒng)全面反映疾病發(fā)生的整體狀況，但耗時長、成本高。李永芹[12]制備了6種病原菌的檢測芯片，可用于海豚鏈球菌、鰻利斯頓氏菌、熒光假單胞菌、海分枝桿菌、遲緩愛德華氏菌、殺鮭氣單胞菌的現(xiàn)場平行檢測，提高了檢測效率，整個檢測過程仍需3 h以上。本研究分別制作了3種常見水產(chǎn)病原菌的試紙條，并將其組裝成三聯(lián)體卡條，僅需5~10 min便可同時檢測3種病原菌，應用起來更加方便，尤其適用于基層推廣及大量樣本的快速篩查，為養(yǎng)殖魚類疾病的現(xiàn)場快速診斷提供技術支持。

注：①1、2、3分別為柱狀黃桿菌試紙條、海豚鏈球菌試紙條、嗜水氣單胞菌試紙條；②a為待檢樣品中含海豚鏈球菌，b為待檢樣品中含柱狀黃桿菌，c為待檢樣品中同時含海豚鏈球菌和柱狀黃桿菌。圖3部分樣品檢測結(jié)果

本研究所制備的3種魚類病原菌三聯(lián)體卡條，對海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌的檢測靈敏度均為3× 105cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測信號后，檢測靈敏度可達3×104cfu/ml，對柱狀黃桿菌的檢測靈敏度為3× 106cfu/ml，銀染后可達3×105cfu/ml，與已報道的溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌檢測試紙條的靈敏度相當，均在105~106cfu/ml。生產(chǎn)上一般認為，病原菌數(shù)量超過104cfu/ml可能導致魚類發(fā)病。但水產(chǎn)病原菌多為條件致病菌，病原菌數(shù)量并非致病的決定性因素，病害發(fā)生是宿主、病原、環(huán)境三方面綜合作用的結(jié)果。因此，本研究所制作的三聯(lián)體卡條檢測結(jié)果對生產(chǎn)上疾病的預防仍具有一定的參考意義。

在細菌檢測應用中，采用全菌抗原制備的單克隆抗體容易出現(xiàn)漏檢情況，尤其是對于抗原結(jié)構(gòu)復雜的細菌來說，單克隆抗體并不占優(yōu)勢，并且單克隆抗體制備技術要求較高，制備周期長從而會增加試紙條的研發(fā)成本。本次所制作的試紙條采用的均為細菌全菌免疫制作的多抗，試驗結(jié)果證實，所制作的試紙條具有較好的特異性和靈敏度，在實際應用中檢測結(jié)果與實驗室檢測相比，符合率在87.7%以上，在一定程度上證明了采用多克隆抗體制備試紙條的可行性。

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（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）

Development and application of triplet-immunochromatographic strip for simultaneous detection of three aquatic pathogens

Liu Yijuan, Sun Jinsheng, Bao Haiyan, Zhang Qin, Zang Li, Xu Xiaoli

Abstract：Immunochromatographic strips for detection of Streptococcus iniae, Flavobacterium colum?nareand Aeromonashydrophilawere developmented respectively and integrated as triplet-immunochro?matographic strip. The triplet-immunochromatographic strip was applied in simultaneous detection of three aquatic pathogens. Results showed that the triplet-immunochromatographic strip had no cross-re?action with other 12 kinds of aquatic pathogens and the sensitivities were both 3×105cfu/ml to S.iniae, A.hydrophila, 3×106cfu/ml to F.columnare. This method was applied in samples of diseased fish and concordance of the triplet-immunochromatographic strip with methods for detection of pathogens in the lab were above 87.7%. The operation was rapid, simple and 3 kinds of pathogens can be detected in 5~ 10 min simultaneously and the detection efficiency was improved. The triplet-immunochromatographic strip could be used in aquaculture on-spot and rapid screening of a large number of samples.

Key words：Flavobacteriumcolumnare；Aeromonas hydrophila；Streptococcus iniae；immunochromato?graphic strip；triplet-immunochromatographic strip

基金項目：天津市科技支撐計劃項目[12ZCZDNC00900]

收稿日期：2015-10-03

通訊作者：徐曉麗，博士。

作者簡介：劉亦娟，碩士，研究方向為魚類病害防治。

中圖分類號：S941

文獻標識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）04-0056-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.014