BDNF在急性應激所致小鼠空間學習記憶功能改變中的作用

肖婧姍　李洋　李娜　李文薈　崔艷飛　胡曉彤　李亞

【摘 要】目的 研究急性應激對小鼠空間學習記憶功能及腦內BDNF表達的影響。方法 采用足底電擊急性應激動物模型，通過Morris水迷宮實驗檢測試小鼠空間學習記憶能力；以免疫組織化學方法檢測腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）在海馬和前腦皮層的表達。結果 與正常對照組小鼠比較，急性應激組小鼠在水迷宮實驗中的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05， P<0.01），而在目標象限的停留時間顯著延長（P<0.05）；急性應激組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)，齒狀回和前腦皮層BDNF的表達明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結論 急性應激導致小鼠空間學習記憶功能增強，這可能與海馬和前腦皮層BDNF表達的上調有關。

【關鍵詞】急性應激；空間學習記憶；BDNF；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the effects of acute stress on the ability of spatial learning and memory and the expression of brain derived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） of mice. Methods Using animal model mice induced by single-factor acute stressor （foot shock）. The ability of spatial learning and memory of mice was measured using Morris water maze， and the expressional changes of BDNF in mice brain were detected by immunohistochemical method. Results Compared with control group mice， the escape latency of the acute stress group mice were shorter（P<0.05， P<0.01）， and the swimming time of the platform quadrant of the acute stress group mice were significantly increased in Morris water maze（P<0.05）. The expression of BDNF in the CA1，CA3 region and dentate gyrus of HP and PFC were significantly increased in stress group mice（P<0.05， P<0.01）， compared with control group mice. Conclusion The results indicated that acute stress induced a significant increase in spatial learning and memory ability， and it may be nearly related to the up-regulation of BDNF expression in HP and PFC.

【Key words】Acute stress； Spatial learning and memory； BDNF； Hippocampus； PFC

腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）屬于神經營養(yǎng)因子家族，在中樞神經系統(tǒng)中的海馬、杏仁核、紋狀體和皮層等部位都有豐富的表達，對神經細胞分化、增殖、營養(yǎng)和成熟都具有重要作用。研究表明，BDNF可增強動物腦內神經細胞間的突觸聯(lián)系，從而使學習記憶功能增強[1]。外界環(huán)境的改變可引起機體產生應激反應。適度的應激可增強機體的抵抗力和適應能力，對維持機體生存具有重要意義，但持久過度的應激則會導致一系列病理現象產生。海馬結構作為邊緣系統(tǒng)中的一個重要組成部位，是介導應激反應的最重要腦區(qū)之一，參與情緒、學習和記憶、行為等功能的調節(jié)[2]。研究表明，動物在急性應激期，相關腦區(qū)的神經元仍保持其完整性， 但中樞神經遞質系統(tǒng)和神經內分泌系統(tǒng)功能活動加強。在中樞神經系統(tǒng)中，與應激關系密切的腦區(qū)除海馬外，還有前額葉皮層、杏仁核、紋狀體等部位[3]。本研究采用急性應激動物模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠的空間學習記憶功能的變化，測定小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達，以探討急性應激對小鼠空間學習記憶功能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康昆明品系小白鼠24只，2月齡，體重18-20g，雌雄各半，由山東魯抗醫(yī)藥公司動物實驗中心提供。實驗小鼠置于自然晝夜節(jié)律光照條件下群養(yǎng)1周以適應環(huán)境，每日撫摸抓捉小鼠，使其適應實驗人員的操作。將小鼠隨機分為正常對照組和急性應激組。急性應激組采用足底電擊的單一應激原（電壓36V，每隔15s刺激一次，每次持續(xù)30s，共30次）；正常對照組動物不接受實驗應激原，以同樣的條件飼養(yǎng)。

1.2 Morris水迷宮小鼠學習記憶能力檢測

急性應激結束后，對正常對照組和急性應激組小鼠進行水迷宮實驗。Morris水迷宮測試程序包括定位航行試驗和空間探索試驗兩部分。水迷宮被均等的分為4個象限，平臺置于第一象限（目標象限），在水池第三象限周邊壁上做明顯標志物，與第一象限平臺連線為圓形水池一直徑。定位航行試驗歷時2天，每只小鼠每天接受8次找平臺訓練，分兩個訓練周期（上午和下午），每個訓練周期4次，每次對應一個象限將小鼠入水，每次訓練2 min。記錄小鼠尋找到隱藏在水面下平臺的時間即逃避潛伏期（escape latency）?？臻g探索試驗是在定位航行試驗后進行，第3天撤除平臺，從第三象限入水點將小鼠放入水中，記錄2 min內小鼠在四個象限的游泳時間，檢測小鼠對原平臺（目標象限）的記憶能力。定位航行試驗每個訓練周期前以及空間搜索試驗前均對應激組小鼠進行足底電擊。

1.3 小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達

急性應激結束后，對急性應激組和正常對照組小鼠，用0.4%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，當即打開胸腔，暴露心臟，經心快速灌注生理鹽水及預冷的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，開顱取腦，后固定2小時；梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，行冠狀切片（片厚約5 μm）。切片嚴格按照試劑盒操作說明進行免疫組織化學染色，以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照，試劑盒購自武漢博士德生物公司。每只小鼠選擇海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回（DG）和前腦皮層（PFC）切片3張，每片各隨機取兩個視野，利用Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統(tǒng)測量BDNF陽性神經元平均目標灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數據以均數±標準差（±s）表示，水迷宮定位航行試驗中的逃避潛伏期采用重復測量的方差分析（one-way repeated -measures ANOVA）；空間搜索試驗中的各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并以LSD法進行組間的兩兩比較。其他數據的組間比較采用非配對t檢驗，以P<0.05表示統(tǒng)計學上具有顯著性差異。

2 結果

2.1 急性應激后小鼠定位航行學習能力的變化

在兩天定位航行試驗中，正常對照組和急性應激組小鼠的逃避潛伏期均明顯下降；具有顯著性差異（F=8.156， P<0.01）；結果顯示（表1），與正常對照組比較，在第一天的訓練周期以及第二天的第一個訓練周期，急性應激組小鼠的逃避潛伏期均縮短，有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）。結果表明，急性應激后小鼠的小鼠的空間學習能力明顯增強。

2.2 急性應激后小鼠空間搜索記憶能力的變化

在空間搜索試驗中，正常對照組和急性應激組小鼠均在目標象限（第一象限）停留時間最長（表2）；且均顯著長于在其它三個象限的時間（正常對照組小鼠F=9.637， P<0.01；急性應激組小鼠F=6.846， P<0.01）。與正常對照組小鼠比較，急性應激組小鼠在目標象限停留的時間顯著延長（P<0.05）。結果表明，急性應激可以明顯增強小鼠的空間記憶保持能力以及對空間定位的準確性。

2.3 急性應激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達的變化

免疫組化染色結果顯示，急性應激后，與正常對照組小鼠相比，急性應激組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG和前腦皮層BDNF的表達明顯增強；與正常對照組小鼠相比（表3），急性應激組小鼠各腦區(qū)GDNF陽性神經元平均目標灰度值顯著減少（P<0.01）。

3 討論

在機體處于不利的環(huán)境條件下可產生一系列的應激反應。許多研究報道，適度的應激對機體有利無害，但過強、持久的應激可影響和改變中樞神經系統(tǒng)中與行為相關的神經元形態(tài)和功能。有研究報道，當人或動物處于強烈的急性應激或長期慢性應激時，其中樞神經系統(tǒng)的功能可受到明顯的影響，特別是引起海馬功能的損害，學習記憶能力顯著損傷[4]。短暫的急性應激可提高動物的學習記憶能力，但也有研究報道，急性應激可減弱動物的學習記憶[5]，這種差異可能與采用的應激強度及方式不同有關。在腦內，海馬、前腦皮層、杏仁核等部位是與應激和學習記憶密切相關的區(qū)域。有研究表明，急性應激對海馬的形態(tài)結構沒有明顯影響，提示急性應激對中樞神經系統(tǒng)的影響可能只涉及突觸傳遞效能的可塑性變化。在本研究中，急性應激后小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，且目標象限停留時間顯著延長，結果說明急性應激明顯增強小鼠的空間學習記憶功能。

BDNF是神經營養(yǎng)因子的一種。有研究報道，BDNF可調控神經細胞的生存、生長、分化和凋亡，增加神經細胞間的突觸聯(lián)系，能有效防止神經元的變性及死亡。因此，它是維持神經元功能和再生修復及防止神經元退行性病變等多方面發(fā)揮重要作用的細胞因子[6]。也有研究報道，BDNF對神經元的可塑性也具有一定的影響作用[7]。研究表明，BDNF mRNA高表達區(qū)在海馬、上丘和大腦皮層，并且在海馬內其表達量可達神經生長因子（NGF）的50倍[8]。我們先前的研究表明[9]，慢性應激導致小鼠Morris水迷宮空間學習記憶功能受損，海馬各區(qū)及前腦皮層BDNF表達降低。而在本研究中，給予小鼠足底電擊急性應激后，應激組小鼠的空間學習記憶能力增強，腦海馬和前腦皮層BDNF的表達明顯增加。結果表明，急性應激后，引起小鼠海馬和前腦皮層神經元功能活動發(fā)生明顯變化。可以推測，BDNF可能參與了急性應激對機體空間學習記憶的影響；急性應激所致小鼠空間學習記憶功能的改變可能與BDNF表達的上調密切相關。

【參考文獻】

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[責任編輯：楊玉潔]