仔豬小腸平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立

田　夢(mèng)，黃　勇，瞿俊勇，歐陽(yáng)芬，鄧　梁，張　玲，潘　多，張明軍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長(zhǎng)沙410006）

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仔豬小腸平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立

田夢(mèng)1，黃勇2，瞿俊勇1，歐陽(yáng)芬1，鄧梁1，張玲1，潘多1，張明軍1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長(zhǎng)沙410006）

摘要：為了建立簡(jiǎn)便、高效的仔豬小腸平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為相關(guān)研究提供試驗(yàn)材料，采用組織貼塊法和酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，胰酶消化傳代，并應(yīng)用倒置顯微鏡和SABC試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定。結(jié)果采用組織塊貼塊法培養(yǎng)的仔豬腸平滑肌細(xì)胞有90%的組織塊接種存活，初次傳代后的平滑肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上。免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)α平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)。而酶消化法培養(yǎng)的仔豬腸平滑肌細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。表明組織塊貼塊法是為簡(jiǎn)便、可靠，短期內(nèi)可獲大量高純度的仔豬小腸平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞：仔豬；小腸平滑肌細(xì)胞；組織貼塊法；酶消化法；細(xì)胞培養(yǎng)

腸平滑肌細(xì)胞（Intestinal smooth muscle cells，ISMC）是腸道的重要功能細(xì)胞，腸平滑肌細(xì)胞的收縮、舒張等活動(dòng)受到神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素和藥物等因素的調(diào)節(jié)[1]。體外培養(yǎng)細(xì)胞，由于影響因素單一，是研究細(xì)胞功能以及相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)多是關(guān)于大鼠的研究，而對(duì)于仔豬胃腸道平滑肌培養(yǎng)的研究，基本處于空白。為了探索一套簡(jiǎn)易實(shí)用的仔豬腸道平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，參照有關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，我們分別采用貼塊法和酶消化法進(jìn)行了仔豬小腸平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將試驗(yàn)情況，報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；胰蛋白酶（Trypsin，Sigma公司）；青、鏈霉素；Ⅱ型膠原酶（MP公司）；胰蛋白酶抑制劑（Amersco公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；Trypan（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；鼠抗α-action克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。PBS緩沖液的配置：NaCl 7.9 g/L，KCl 0.2 g/L，NaH2PO40.24 g/L，K2HPO41.8 g/L，用NaOH調(diào)pH值到7.4。

1.2儀器MCO-18AC型二氧化碳培養(yǎng)箱；VS-840K-U型潔凈工作臺(tái)；Z323K型低溫冷凍高速離心機(jī)；LDZX-30FB型高溫滅菌器；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；倒置相差顯微鏡和常用移液器具等。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物剛出生未進(jìn)食未喝水的仔豬，由永州佳和農(nóng)牧有限公司提供。

2　試驗(yàn)方法

2.1仔豬小腸平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法

2.1.1組織貼塊法分離仔豬小腸平滑肌細(xì)胞參考Bitar方法加以改進(jìn)[4]。將剛出生且未進(jìn)食未吃奶的仔豬放血處死，立即無(wú)菌剖開(kāi)腹腔，取十二指腸10 cm左右，生理鹽水中反復(fù)灌腸沖洗，剪開(kāi)后移入含300 IU/mL青霉素、300 μg/mL鏈霉素的PBS緩沖液中浸泡15 min后，取出，移入含PBS緩沖液的玻璃培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用皮內(nèi)針固定好四角，仔細(xì)剝離黏膜層，翻轉(zhuǎn)至外側(cè)，小心地撕去腸系膜，再仔細(xì)刮去漿膜層，反復(fù)用攝子側(cè)腳刮腸段的內(nèi)外層，直至在顯微鏡下觀察到腸段呈透明的一層為止。將組織層剪碎成l～2 mm3的小肌塊，用PBS沖洗3次后，將剪碎的小肌塊放入60 mm培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿底部先用含20%胎牛血清的DMEM濕潤(rùn)），間距約為0.4 cm左右，用吸管均勻擺放瓶?jī)?nèi)組織塊，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)皿底部朝上，放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 h后，待組織塊干涸并與皿底貼附后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，輕柔地加入3 mL DMEM培養(yǎng)基，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)，2 d后換液，期間不要?jiǎng)优囵B(yǎng)皿，以免組織塊浮起，以后每2～3天換液1次。當(dāng)組織塊周圍有細(xì)胞游出并達(dá)到1定密度時(shí)，將小肌塊取出，繼續(xù)培養(yǎng)，只到形成單層致密細(xì)胞。

2.1.2酶消化法小腸段的前處理同組織貼塊法，將組織塊剪碎后放入10 mL離心管內(nèi)，加入含0.1 %Ⅱ型膠原酶和0.01%胰蛋白酶抑制劑的PBS 10 mL，37℃下消化15 min，每2 min搖動(dòng)離心管，使組織充分與酶反應(yīng)。當(dāng)組織塊變白松軟，且液體渾濁后，加培養(yǎng)液終止消化，l 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，60目篩網(wǎng)過(guò)篩，即得到游離的仔豬腸平滑肌細(xì)胞。放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3天換液1次。

2.2傳代培養(yǎng)與細(xì)胞鑒定細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)，即可用胰酶消化傳代；取原代長(zhǎng)至融合的仔豬腸平滑肌細(xì)胞接種于預(yù)置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片的六孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)5 d后進(jìn)行α-actin免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)ABC法對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

3　結(jié)果

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3.1.1組織貼塊法組織貼塊5 d后，在組織塊邊緣幵始有細(xì)胞游出，呈長(zhǎng)梭狀，比較稀疏。在第l0天時(shí)，組織塊周圍長(zhǎng)滿細(xì)胞，不均勻排列，呈簇狀，細(xì)胞形態(tài)不一，有梭狀、橢圓狀、圓形等（圖1-A）。第12天時(shí)，細(xì)胞均勻密集的從組織塊周圍長(zhǎng)出，且鋪滿皿底（圖1-B）。傳代培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，以后幾天細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，第11天在培養(yǎng)皿內(nèi)才長(zhǎng)出稀疏平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀，有的呈放射狀或漩渦狀。存活率達(dá)90%以上。

圖1　貼塊法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細(xì)胞（40×）A：組織塊周圍長(zhǎng)滿仔豬腸平滑肌細(xì)胞；B：鋪滿皿底的仔豬腸平滑肌細(xì)胞

3.1.2酶消化法剛分離出來(lái)時(shí)，在倒置顯微鏡下可以看到有單個(gè)的圓形的細(xì)胞，也伴有部分雜質(zhì)，見(jiàn)圖2A。經(jīng)過(guò)10 d的培養(yǎng)后，仍不見(jiàn)細(xì)胞貼壁，且原本能清楚看到的圓形細(xì)胞也不見(jiàn)了，只剩下一些類似雜質(zhì)的黑點(diǎn)，見(jiàn)圖2B。

3.2免疫組化鑒定應(yīng)用（α-actin單克隆抗體免疫組化染色，可見(jiàn)細(xì)胞被染成棕色或淺棕色，核不著色，呈淺藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)；陰性對(duì)照組，細(xì)胞不被染色。見(jiàn)圖3（A、B）。經(jīng)免疫組化鑒定，組織貼塊法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細(xì)胞可獲得高純度（免疫組化鑒定α-actin的陽(yáng)性率達(dá)95%以上）的細(xì)胞，且生長(zhǎng)良好。為研究藥物對(duì)細(xì)胞的作用及信號(hào)傳導(dǎo)提供基礎(chǔ)。

圖2　酶消化法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細(xì)胞A：酶消化法分離仔豬腸平滑肌細(xì)胞（40×）；B：仔豬腸平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)10 d后（40×）

圖3　仔豬腸平滑肌細(xì)胞免疫組化鑒定A：組織塊培養(yǎng)法的仔豬腸平滑肌細(xì)胞免疫組化（40×）；B：組織塊培養(yǎng)法的仔豬腸平滑肌細(xì)胞免疫組化陰性對(duì)照（40×）

4　討論

關(guān)于平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的研究有不少報(bào)道，但大多都是關(guān)于血管平滑肌細(xì)胞。一方面因?yàn)槟c道屬于消化器官，與細(xì)菌的接觸機(jī)會(huì)較大，容易污染；另一方面，仔豬不似一般試驗(yàn)動(dòng)物，成本較高。此外，腸道的結(jié)構(gòu)不同于血管。腸道分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，而血管分為外膜、中膜和內(nèi)膜，中膜較厚，主要由大量環(huán)形排列的平滑肌纖維組成。在分離肌層時(shí)，腸道與血管比較，操作更加復(fù)雜。所以，在分離結(jié)腸平滑肌層時(shí)應(yīng)盡可能仔細(xì)、反復(fù)地刮除黏膜、黏膜下層及漿膜層，在體視顯微鏡下操作更能確保分離、得到的組織是較純的平滑肌組織。

筆者嘗試的酶消化法，雖然其培養(yǎng)周期短，但酶作用時(shí)間不易掌握，且消化酶本身對(duì)細(xì)胞有一定的損傷作用，導(dǎo)致培養(yǎng)失??；雖然組織塊法培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，但操作相對(duì)簡(jiǎn)便，污染機(jī)會(huì)小，培養(yǎng)效率高[5-6]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，我們更推薦用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行仔豬平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

筆者將試驗(yàn)中的一些體會(huì)及需注意的要點(diǎn)總結(jié)如下：首先必須在無(wú)菌條件下取材，取材后小腸立即置入含300 IU/mL青霉素、3000 μg/mL鏈霉素的PBS中，腸段從離體到完成原代培養(yǎng)的時(shí)間要盡量短（本試驗(yàn)時(shí)間均控制在1 h以內(nèi)），以保證細(xì)胞能在最快的時(shí)間獲得營(yíng)養(yǎng)，植塊體積以0.5～1 mm3/塊為宜，如果植塊過(guò)大，貼壁后植塊內(nèi)部的平滑肌細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)攝取不足，而不易遷出向外生長(zhǎng)，剪切植塊的邊緣要盡量整齊，有利于細(xì)胞的游出。植塊貼壁干涸3～4 h后再加培養(yǎng)基，這既可使植塊貼壁較緊，又不會(huì)因干涸貼壁時(shí)間太長(zhǎng)使細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)而影響生長(zhǎng)。在原代培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液用量不應(yīng)超過(guò)1 mL（以60 mm培養(yǎng)皿為例），以0.5～1 mL為佳，僅夠保持植塊濕潤(rùn)即可。培養(yǎng)液量太多，會(huì)使植塊漂浮而貼壁失敗。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)必須絕對(duì)靜置3 d，培養(yǎng)瓶不能震動(dòng)和移動(dòng)，以防剛貼壁的細(xì)胞重新漂浮而死亡，影響存活率。

參考文獻(xiàn)：

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Establishment of methods on culturing And Identificating Piglet′s intestinal smooth musclecells in vitro

TIAN Meng1，HUANG Yong2，QU Jun-yong1，OUYANG Fen1，DENG Liang1，ZHANG Ling1，PAN Duo1，ZHANG Ming-jun1
（1.College of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Institute of Veterinary Drug and Feed Control，Changsha 410006，China）

Abstract：In order to establish a simple and effective method of culturing piglet′s intestinal smooth muscle cells in vitro，and to provide test material for the related studies，tissue-piece inoculation and collagenase digestion were adopted to culture the primary piglet′s intestinal smooth muscle cells，respectively，and then rypsin digestion was used to transfer them.The cultured cells were identified by morphology and immunohistochemistry with inverted microscope and SABC kit.The result showed that about 90%inoculated tissue pieces survived through tissue-piece inoculation and the purity of the piglet′s intestinal smooth muscle cells by the first passage was more than 95%.And these cells were positive with the immunohistochemically staining against mouse SM-α-actindemonstrated by specific mAb.At the same time，the cells cultured by collagenase digestion grew very slowly，or even died.Our results indicate that tissue-piece inoculation is a simple and reliable method to obtain highly purified pigler’s intestinal smooth muscle cells in short term.

Key words：Piglet；intestinal smooth cells；tissue-piece inoculation；collagenase digestion；cell culture

Corresponding author：ZHANG Ming-jun

通訊作者：張明軍，E-mail：zhmj6997@163.com

作者簡(jiǎn)介：田夢(mèng)（1990-），女，碩士生，從事獸醫(yī)臨床藥學(xué)研究，E-mail：554231628@qq.com

收稿日期：2014-04-03

中圖分類號(hào)：S828.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0038- 03