洪鈺杰，鐘國強，蔣智淵，方曙，孫培震

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內皮素-1在心房顫動發(fā)生中的機制探討

洪鈺杰，鐘國強，蔣智淵，方曙，孫培震

摘要

關鍵詞心房顫動；內皮素-1；心房纖維化

作者單位：530021 廣西省南寧市，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 心血管內科

Effect of Endothelin-1 on Atrial Fibrosis in Patients With Atrial Fibrillation

HONG Yu-jie, ZHONG Guo-qiang, JIANG Zhi-yuan, FANG Shu, SUN Pei-zhen.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China
Corresponding Author: ZHONG Guo-qiang, Email: gq_zhong@126.com

Abstract

Objective: To explore the effect of endothelin-1 on atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation (AF).

Methods: A total of 72 patients with thoracotomy were studied, the patients were divided into 2 groups: AF group, n=39 and Sinus rhythm (SR) group, n=33.The mRNA and protein expressions of endothelin-1 (ET-1), platelet derived growth factor-B (PDGF-B) and collagen I (COL1) in right atrial appendage (RAA) tissue were measured by RT-PCR and Western blot analysis; meanwhile, the impact of ET-1 stimulation and non-selective ET-1 receptor antagonist (sulfafurazole SIZ) on PDGF-B mRNA and protein expressions in H9c2 cells were measured.

Results: ①The RAA tissue mRNA and protein expressions in AF group were higher than those in SR group, as for ET-1 (2.830 ± 2.276) vs (1.220 ± 0.887) and (0.835 ± 0.241) vs (0.286 ± 0.083), both P<0.01; for PDGF-B (2.568 ± 2.348) vs (1.567 ± 0.831) and (0.807±0.241) vs (0.381 ± 0.105), both P<0.05; for COL1 α1 (3.376 ± 1.598) vs (1.629 ± 0.833) and (0.652 ± 0.210) vs (0.312 ± 0.12), both P<0.05.②The protein expressions of ET-1 and COL1 had positive correlation (r=0.580, P<0.01).③ET-1 promoted PDGF-B secretion in H9c2 cells in a concentration and time-dependent manner; SIZ could reduce such promotion.

Conclusion: ET-1 plays an important role in AF occurrence which might be related to PDGF-B regulation.

Key words Atrial fibrillation; Endothelin-1; Atrial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:146.)

心房顫動（房顫）是臨床上最常見的心律失常，致殘、致死率高。房顫發(fā)病機制復雜，心房重構是其中心環(huán)節(jié)。心房纖維化作為心房結構重構最顯著的特征，與房顫的發(fā)生密切相關[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者心房組織和外周血內皮素-1（ET-1）表達升高[2-5]，但ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用，目前尚不清楚。已有的研究表明，ET-1與心肌纖維化密切相關[6]，并且ET-1對血小板衍生生長因子（PDGF）具有調控作用[7]。PDGF-B是重要的致心房纖維化因子[8]，ET-1是否通過調控PDGF-B促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生？目前尚少見報道。本研究旨在初步探討ET-1在房顫發(fā)生中的作用和可能的作用機制。

1　資料與方法

對象：選擇2012-10至2014-06我院心臟外科住院的72例心臟外科手術患者為研究對象，分為房顫組（39例）和竇性心律（竇律）組（33例）。其中，心臟瓣膜病患者61例，房間隔缺損患者6例，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者5例。排除標準：（1）合并感染性心內膜炎；（2）合并風濕活動征象；（3）高血壓；（4）內分泌紊亂、甲狀腺功能亢進；（5）自身免疫性疾??；（6）嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤；（7）年齡＜18歲；（8）心臟二次手術者。本研究所有入選患者簽署書面知情同意書，并獲得廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

兩組患者性別、年齡、基礎心臟疾病（除外聯(lián)合瓣膜病變）、紐約心臟協(xié)會（NYHA）心功能等差異無統(tǒng)計學意義，但房顫組患者左心房內徑明顯大于竇律組（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義。（表1）

右心耳標本獲取：于建立體外循環(huán)插腔靜脈管前，切開右心耳時切取約150 mg右心耳組織，部分放入液氮中凍存，部分用4%多聚甲醛固定。

細胞培養(yǎng)：H9c2細胞系（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）在含有10% 胎牛血清（Gibco），2 mM 谷氨酰胺，100 U/ ml 青霉素和100 μg/ ml鏈霉素的HG-DMEM 培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁和生長情況，待細胞約80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細胞傳代，按1:2分瓶接種，每隔48～72 h更換培養(yǎng)基1次。

ET-1干預H9c2細胞：ET-1（PROSPEC）干預前H9c2細胞以無血清培養(yǎng)基同步化24 h。H9c2細胞在含ET-1（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h；此后，H9c2細胞在含ET-1 10 nmol/L培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 、72 h；最后，H9c2細胞在含ET-1 10 nmol/L+ SIZ[9]（Sigma，美國）2 mmol/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

表1　兩組患者一般臨床資料的比較[例（%）]

右心耳組織馬松（Masson）染色：右心耳組織固定后石蠟包埋，制成5 μm石蠟切片，脫蠟、梯度酒精脫水處理，蘇木素—伊紅染色10 min，Masson復合染液染色5 min，0.2%磷酸鎢酸處理切片5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次。亮綠染色5 min，常規(guī)無水乙醇脫水、透明及封固，光學顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野進行拍照。

實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）：（1）組織及細胞總RNA提?。?Trizol（Invitrogen）提取組織和細胞總RNA，NanoDrop2000型微量分光光度計測定RNA的OD280/OD260值（1.8～2.0）；（2）cDNA合成：按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TAKARA）試劑盒說明書操作，進行總RNA逆轉錄反應；（3）引物設計與合成：人ET-1、PDGF-B、I型膠原α1亞基（COL1α1）和內參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物，大鼠PDGF-B和內參照GAPDH引物由日本TAKARA公司設計合成（表2）；（4）熒光定量PCR: 按SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TAKARA）說明書操作，使用ABI 7300熒光定量PCR儀檢測人ET-1、PDGF-B、COL1α1，大鼠PDGF-B mRNA相對表達量，結果以2-△△CT表示。

表2　基因引物序列

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測：提取右心耳組織和細胞總蛋白，各蛋白樣孔蛋白上樣總量30 μg；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；濕法轉膜；孵育一抗（4℃過夜）：抗ET-1鼠單克隆抗體 (Abcam） 1:500、抗PDGF-B兔單克隆抗體(Abcam） 1：1 000、抗COL1鼠單克隆抗體(Abcam） 1：500、抗GAPDH鼠單克隆抗體（Sigma）1：10 000；孵育二抗（常溫1～2 h）：熒光標記羊抗鼠IgG抗體（Licor） 1:10 000、熒光標記羊抗兔IgG抗體（Rockland）1:10 000；Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃膜，以GAPDH為內參照，檢測人ET-1、PDGF-B、COL1及大鼠PDGF-B蛋白相對表達，結果以目的蛋白條帶與相應內參蛋白條帶的灰度值比值表示。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以率或百分比表示；兩組間計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；多組間總體均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較，采用q檢驗；單因素相關分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組患者右心耳ET-1表達

房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達水平（2.830±2.276）明顯高于竇律組（1.220 ±0.887）（t=4.068，P<0.01）；蛋白表達水平（0.835±0.241）亦明顯高于竇律組（0.286±0.083）（t=-13.309， P<0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖1A）

2.2兩組患者右心耳PDGF-B表達

房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達水平（2.568±2.348）明顯高于竇律組（1.567 ±0.831）（t=2.482，P<0.05）；蛋白表達水平（0.807±0.241）亦明顯高于竇律組（0.381±0.105）（t=-10.860，P<0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖1B）

2.3兩組患者右心耳COL1表達

房顫組患者右心耳COL1α1 mRNA表達水平（3.376±1.598）明顯高于竇律組（1.629±0.833）（t=5.941，P<0.05）；COL1蛋白表達水平（0.652±0.210）亦明顯高于竇律組（0.312±0.122） （t=-8.565，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖1C）

注：AF：房顫組；SR：竇律組；ET-1：內皮素-1；PDGF-B：血小板衍生生長因子-B；COL1：I型膠原；GAPDH: 磷酸甘油醛脫氫酶

2.4ET-1與COL1相關性分析

單因素相關分析顯示兩組患者右心耳COL1蛋白表達水平與ET-1蛋白表達水平呈明顯的正相關（r=0.580，P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義。

2.5兩組患者右心耳膠原纖維沉積

Masson染色提示房顫組患者右心耳膠原纖維沉積明顯多于竇律組患者，呈粗大的束狀包裹、分隔心肌纖維。（圖2）

圖2　兩組患者右心耳膠原纖維沉積

2.6ET-1對H9c2細胞PDGF-B分泌的影響

（1）不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B mRNA表達的影響：與0 nmol/L（1.043±0.102）比較，1 nmol/L ET-1（1.314±0.131，q=6.335，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（1.671±0.131，q=14.687，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（1.973±0.145，q=21.737，P<0.01）、H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平明顯升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=8.352，P<0.01）、100 nmol/L (q=7.050，P<0.01） PDGF-B mRNA表達水平進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義。

（2）不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響：與0 nmol/L（0.070±0.028）比較，1 nmol/L ET-1（0.163±0.025，q=7.111，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（0.355±0.043，q=21.792，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（0.623±0.053，q=42.267，P<0.01）H9c2細胞PDGF-B蛋白表達水平明顯升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=14.681，P<0.01）、100 nmol/ L（q=20.475，P<0.01）PDGF-B蛋白表達水平進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義。(圖3）

圖3　不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響

（3）ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B mRNA表達的影響：與0 h（0.966±0.131）比較，24 h（1.671±0.131，q=13.151，P<0.01）、48 h（1.999±0.178，q=19.277，P<0.01）、72 h （2.278±0.194，q=24.462，P<0.01）H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平明顯升高，且24 h、48 h （q=6.126，P<0.01）、72 h（q=5.185，P<0.01）PDGF-B mRNA表達水平進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義。

（4）ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響：與0 h（0.069±0.019）比較，24 h（0.355±0.043，q=23.428，P<0.01）、48 h （0 .6 2 8±0 .0 3 8，q = 4 5 .7 6 9，P< 0 .0 1）、72 h（0.750±0.041，q=55.721，P<0.01） H9c2細胞PDGF-B蛋白表達水平明顯升高，且24 h、48 h（q=22.341，P<0.01）、72 h（q=9.952，P<0.01）PDGF-B蛋白表達水平進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義。（圖4）

圖4　ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響

（5）內皮素拮抗劑對ET-1培養(yǎng)下H9c2細胞PDGF-B表達的影響：與10 nmol/L ET-1比較，ET-1 10 nmol/L+ SIZ 2 mmol/L的H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平（1.426±0.130）明顯下降（t=3.633，P<0.01）；PDGF-B蛋白水平（0.246±0.022）也明顯下降（t=6.510，P<0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖3）

3　討論

內皮素是一種由21個氨基酸殘基組成的活性多肽，主要由內皮細胞分泌，心肌細胞和成纖維細胞等也有一定表達。ET-1是人體最主要的內皮素，它促進成纖維細胞向肌樣成纖維細胞分化，增加細胞外基質合成，是導致心肌纖維化的重要因素[6，10-12]。

近來，ET-1在房顫發(fā)病中的作用越來越受重視。Zakeri 等[3]研究表明，與單純的心力衰竭患者相比，合并房顫者血漿ET-1表達更高。Abed等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著山羊體重的增加，其心房ET-1及內皮素受體ETA和ETB表達增加，房顫發(fā)生的風險明顯升高。Mayyas等[14]發(fā)現(xiàn)通過飲食補充ω3不飽和脂肪酸可以減少實驗犬心臟術后房顫的發(fā)生，并且降低血漿ET-1表達。Nakazawa等[15]發(fā)現(xiàn)術前血漿ET-1表達水平是預測環(huán)肺靜脈消融術后3～6個月復發(fā)率的重要指標。Latini等[16]也發(fā)現(xiàn)，房顫時血漿ET-1前體肽增加，是預測房顫復發(fā)的良好指標。上述研究的共同特點在于，房顫時血漿或是心房ET-1表達明顯升高，可見ET-1過度表達在房顫發(fā)病中起著重要作用。遺憾的是，上述研究均未對ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用進行深入的研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，房顫組患者右心耳ET-1、COL1表達以及膠原纖維沉積均明顯高于竇律組，且兩組患者右心耳COL1表達水平與ET-1表達水平呈明顯的正相關，提示ET-1可能通過促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生。Mayyas等[4]研究結果與我們的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)器質性心臟病患者左心耳ET-1表達水平與左心房大小、心房纖維化程度以及房顫的發(fā)生有明顯的相關性。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，ET-1可以促進H9c2細胞PDGF-B mRNA和蛋白的合成，并且表現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。SIZ可以減弱ET-1對H9c2細胞PDGF-B合成的促進作用。上述結果表明ET-1可在基因轉錄水平對PDGF-B信號通路進行調控。

PDGF是多種間充質來源細胞（如成纖維細胞、血管平滑肌細胞等）的主要絲裂原，促進間充質細胞生長、遷移、增殖、分化及細胞外基質的合成，在組織損傷后修復中起著重要作用。但病理狀態(tài)下，過度激活的PDGF可使成纖維細胞轉化為肌樣成纖維細胞，分泌多種細胞外基質，導致心房纖維化，促進房顫的發(fā)生[8]。PDGF主要以旁分泌的形式作用于其效應細胞，其受體（PDGFR）在成纖維細胞高度表達[17]，因此心房成纖維細胞是PDGF最主要的效應細胞之一。據(jù)此我們推測，ET-1可能通過刺激心房肌細胞合成PDGF-B，并以旁分泌的形式作用于心房成纖維細胞，促進其分泌細胞外基質，導致心房纖維化和房顫的發(fā)生。

我們的研究表明，ET-1可能通過上調PDGF-B促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生，有望為房顫的干預提供新的靶點。但目前只是體外實驗的結果，有待于體內實驗進一步驗證。另一方面，由于病例數(shù)有限，研究中大部分為心臟瓣膜病患者，僅有少部分為非心臟瓣膜病患者，ET-1在非瓣膜病性房顫中的作用是否如此，仍有待考證。進一步收集病例，探討ET-1在不同基礎心臟疾病房顫發(fā)生中的作用，將更加有利于問題的闡明。此外，ET-1促進心肌細胞PDGF-B分泌的具體機制仍有待進一步探索，我們將在今后的研究中逐步完善。

參考文獻

[1] Nattel S, Harada M.Atrial remodeling and atrial fibrillation: recent advances and translational perspectives.J Am Coll Cardiol, 2014, 63: 2335-2345.

[2] Lewicka E, Dudzinska-Gehrmann J, Dabrowska-Kugacka A, et al.Neurohumoral factors as markers of recurrence of atrial fibrillation examined in patients with dual-chamber pacemaker.Int J Cardiol, 2014, 175: 213-214.

[3] Zakeri R, Borlaug BA, McNulty SE, et al.Impact of atrial fibrillation on exercise capacity in heart failure with preserved ejection fraction: a RELAX trial ancillary study.Circ Heart Fail, 2014, 7: 123-130.

[4] Mayyas F, Niebauer M, Zurick A, et al.Association of left atrial endothelin-1 with atrial rhythm, size, and fibrosis in patients with structural heart disease.Circ Arrhythm Electrophysiol, 2010, 3: 369-379.

[5] 鄭黎暉, 姚焰, 吳靈敏, 等.孤立性心房顫動患者血漿高敏C反應蛋白與大內皮素-1濃度變化及相互的關系.中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 240-243.

[6] Leask A.Potential therapeutic targets for cardiac fibrosis: TGFbeta, angiotensin, endothelin, CCN2, and PDGF, partners in fibroblast activation.Circ Res, 2010, 106: 1675-1680.

[7] Jaffer FE, Knauss TC, Poptic E, et al.Endothelin stimulates PDGF secretion in cultured human mesangial cells.Kidney Int, 1990, 38: 1193-1198.

[8] Wakili R, Voigt N, Kaab S, et al.Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.J Clin Invest, 2011, 121: 2955-2968.

[9] Syed H, Safa R, Chidlow G, et al.Sulfisoxazole, an endothelin receptor antagonist, protects retinal neurones from insults of ischemia/ reperfusion or lipopolysaccharide.Neurochem Int, 2006, 48: 708-717.

[10] Wang X, Guo Z, Ding Z, et al.Endothelin-1 upregulation mediates aging-related cardiac fibrosis.J Mol Cell Cardiol, 2015, 80: 101-109.

[11] Catar RA, Muller G, Brandt A, et al.Increased gene expression of the cardiac endothelin system in obese mice.Horm Metab Res, 2015, 47: 509-515.

[12] Widyantoro B, Emoto N, Nakayama K, et al.Endothelial cellderived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts throughstimulation of endothelial-to-mesenchymal transition.Circulation, 2010, 121: 2407-2418.

[13] Abed HS, Samuel CS, Lau DH, et al.Obesity results in progressive atrial structural and electrical remodeling: implications for atrial fibrillation.Heart Rhythm, 2013, 10: 90-100.

[14] Mayyas F, Sakurai S, Ram R, et al.Dietary omega3 fatty acids modulate the substrate for post-operative atrial fibrillation in a canine cardiac surgery model.Cardiovasc Res, 2011, 89: 852-861.

[15] Nakazawa Y, Ashihara T, Tsutamoto T, et al.Endothelin-1 as a predictor of atrial fibrillation recurrence after pulmonary vein isolation.Heart Rhythm, 2009, 6: 725-730.

[16] Latini R, Masson S, Pirelli S, et al.Circulating cardiovascular biomarkers in recurrent atrial fibrillation: data from the GISSI-atrial fibrillation trial.J Intern Med, 2011, 269: 160-171.

[17] Donovan J, Abraham D, Norman J.Platelet-derived growth factor signaling in mesenchymal cells.Front Biosci (Landmark Ed),2013,18: 106-119.

（編輯：漆利萍）

收稿日期：（2015-05-20）

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）02-0146-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.011

作者簡介：洪鈺杰 碩士研究生 主要從事心律失常的基礎與臨床研究 Email：15077177145@163.com 通訊作者：鐘國強Email：gq_zhong@126.com

基金項目：廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019167) ；國家自然科學基金課題地區(qū)科學基金項目(81460057)

目的：探討內皮素-1（ET-1）在心房顫動（房顫）和心房纖維化中的作用。

方法：72例開胸手術患者，分為房顫組（39例）和竇性心律（竇律）組（33例）。實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）及蛋白免疫印跡（Western blot）分別檢測兩組患者右心耳ET-1、血小板衍生生長因子-B（PDGF-B）、I型膠原（COL1）mRNA和蛋白表達水平。同時，檢測ET-1刺激以及非選擇性ET-1受體拮抗劑（磺胺異惡唑，Sulfafurazole，SIZ）對H9c2細胞PDGF-B mRNA和蛋白表達水平的影響。

結果：（1）房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達水平和蛋白表達水平明顯高于竇律組（2.830±2.276 vs 1.220 ±0.887）和（0.835±0.241 vs 0.286±0.083），P均<0.01。房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達水平和蛋白表達水平明顯高于竇律組（2.568±2.348 vs 1.567±0.831）和（0.807±0.241 vs 0.381±0.105），P均<0.05。房顫組患者右心耳I型膠原α1亞基（COL1α1） mRNA表達水平（3.376±1.598） 明顯高于竇律組（1.629±0.833），P<0.05；蛋白表達水平（0.652±0.210）亦明顯高于竇律組（0.312±0.122），P<0.05。（2）兩組患者右心耳I型膠原蛋白表達水平與ET-1蛋白表達水平呈明顯的正相關（r=0.580，P<0.01）。（3）ET-1促進H9c2細胞分泌PDGF-B，并表現(xiàn)出濃度和時間依賴性。SIZ可減輕上述效應。

結論: ET-1在房顫的發(fā)生中起著重要作用，其可能通過調控PDGF-B促進心房纖維化而導致房顫的發(fā)生。