吳　朗,黃　成,楊建東

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225000)

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Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的作用研究進(jìn)展

吳朗,黃成,楊建東

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225000)

關(guān)鍵詞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 細(xì)胞分化; 神經(jīng)細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為源于胚胎中胚層的早期細(xì)胞[1],其來源豐富，易于分離純化，且具有多向分化潛能、低免疫排斥反應(yīng)等特點。近年來，在組織工程、細(xì)胞移植治療腦、脊髓損傷領(lǐng)域取得令人鼓舞的成就。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs于移植區(qū)域分化為神經(jīng)樣細(xì)胞是治療腦、脊髓損傷的重要因素，但目前對該細(xì)胞神經(jīng)分化機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識。另有研究[2]報道Wnt信號通路為細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，有助于各類神經(jīng)元的分化以及促進(jìn)神經(jīng)元極性建立和軸突生長[3]，這表明Wnt 信號系統(tǒng)在促進(jìn)神經(jīng)元的增殖和分化等生物學(xué)功能中起著重要的作用，已有研究發(fā)現(xiàn)其各組分在BMSCs 中均有表達(dá)，但目前對Wnt參與誘導(dǎo)BMSCs 分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的分子機(jī)制了解不多，本文從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化和信號通路兩方面進(jìn)行綜述，以期為拓展BMSCs研究、應(yīng)用領(lǐng)域供理論依據(jù)。

1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特點

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞。其含量很低，約占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01%[4]，故需對其進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)才能實現(xiàn)它的利用價值。目前獲得BMSCs的方法主要有:全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法以及免疫磁珠分選法[5]。楊麗等[6]發(fā)現(xiàn)全骨髓貼壁培養(yǎng)法較密度梯度離心法操作簡單且細(xì)胞貼壁時間短、增殖快、數(shù)量多。體外培養(yǎng)的BMSCs呈梭形或多角形，多呈“漩渦狀”生長。與其它細(xì)胞一樣，在體外培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)歷生長滯緩期、對數(shù)增殖期以及生長平臺期。研究[7]報道，體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞大多數(shù)處于G0/G1期，而復(fù)制活躍的細(xì)胞僅占10%，高比例的G0/G1期細(xì)胞暗示著BMSCs具有高度的分化潛能。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)BMSCs的特異性的抗原表型，它主要表達(dá)一些非特異性的表面標(biāo)志如CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD146+以及少量的MHC-Ι類分子，不表達(dá)CD11b、CD14、CD45、CD34[8]。正是MHC-Ι類分子的低表達(dá)、MHC-II類分子和共刺激分子(如CD40、CD80)的缺乏促成了BMSCs的低免疫原性[9]，不易引起免疫排斥反應(yīng)。對于BMSCs的鑒定，多數(shù)學(xué)者[10]認(rèn)為應(yīng)采用逆向推斷的方法，即根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖能力、表面標(biāo)志和多向分化的特點來判斷。

2Wnt信號通路概述

Wnt一詞是wingless和Int-1的合稱[11]。20世紀(jì)80年代,Nusse等在研究鼠乳腺癌的過程了發(fā)現(xiàn)了小鼠的原癌基因Int-1,隨后發(fā)現(xiàn)Int-1和果蠅的無翅基因Wingless有高度的同源性，故將二者合并為Wnt。Wnt基因編碼一類分泌型糖蛋白，含一段疏水的信號肽和23或24個保守位置的半胱氨酸殘端，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。

Frizzled(Fzd)蛋白是Wnt蛋白的受體，為七次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)上類似于G蛋白偶聯(lián)受體。Fzd的胞外區(qū)有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD),能與Wnt配體結(jié)合。不同的Fzd受體與相應(yīng)的Wnt蛋白結(jié)合可以激活不同的下游信號途徑，包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑及非經(jīng)典途徑[12]。Wnt信號通路中另外一種重要的受體是脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6),它位于成骨細(xì)胞膜Fzd受體和Kremen受體之間。

Wnt信號通路包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典通路，其中非經(jīng)典通路包括Wnt/Ca2+、Wnt/PCP、Wnt/c-Jun和Wnt/Rho通路[13]。在經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中，β-聯(lián)蛋白(β-catenin)起到關(guān)鍵的作用。在正常情況下，部分β-catenin與細(xì)胞膜上的鈣黏附蛋白結(jié)合，其余的β-catenin與結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白(APc)、軸素多聚蛋白(axin)復(fù)合物結(jié)合。而糖原合成酶激酶(GSK-3β)可以磷酸化與上述復(fù)合物結(jié)合的β-catenin，使之在泛素蛋白酶體系的作用下被降解，從而保持胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin濃度處于較低的狀態(tài)[14]。當(dāng)經(jīng)典Wnt信號通路活化時,Wnt蛋白與Fzd以及LRP5/6結(jié)合，激活胞內(nèi)的散亂蛋白(Dishevelled，Dvl/Dsh)抑制GSK-3β的活性，引起β-catenin在胞內(nèi)積累并結(jié)合核蛋白Nup62、Nup153、RanBP2進(jìn)入胞核[15]，與T細(xì)胞因子以及淋巴樣增強(qiáng)因子結(jié)合激活靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，Wntl、Wnt2a、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wntl0b的信號傳導(dǎo)多經(jīng)過此通路，而非經(jīng)典信號通路多由Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、Wnt11激活。

3Wnt信號通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化

3.1Wnt信號通路與BMSCs增殖

研究表明,BMSCs具有很強(qiáng)的體外增殖能力。目前多認(rèn)為Wnt信號通路對BMSCs的增殖起著雙向調(diào)節(jié)的作用。Baksh D等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a能夠促進(jìn)BMSCss增殖，而Wnt5a則可通過激活非經(jīng)典Wnt信號途徑拮抗wnt3a,抑制BMSCs增殖。研究[17]認(rèn)為，Wnt3a的這種促進(jìn)增殖的作用可能與cyclinD1的上調(diào)以及c-myc的表達(dá)有關(guān)。雖然Wnt3a在單獨作用的情況下可以促進(jìn)其增殖，但聯(lián)合不同誘導(dǎo)劑后卻起著促分化作用。曹玉凈等[18]用Western blot檢測細(xì)胞增殖標(biāo)記分子Ki67,發(fā)現(xiàn)下調(diào)BMSCs Wnt6基因后顯著抑制Ki67的表達(dá)，而上調(diào)Wnt6基因后則顯著促進(jìn)Ki67的表達(dá)，這表明Wnt6能夠促進(jìn)BMSCs的增殖。Wnt信號通路可以在不同的水平上調(diào)控BMSCs的增殖，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.2Wnt信號通路對BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用

Woodbury等[19]在體外用二甲基亞砜和丁基羥基茴香醚成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，這表明BMSCs可以向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。目前，體外誘導(dǎo)BMSCs神經(jīng)分化的方法眾多，主要有細(xì)胞因子誘導(dǎo)法、細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)法、藥物誘導(dǎo)法、核酸及其衍生物誘導(dǎo)法等，但對其誘導(dǎo)分化機(jī)制的研究甚少。大量研究表明，在BMSCs神經(jīng)分化的過程中Wnt信號通路起重要的作用，現(xiàn)將其歸納如下。

β-catenin作為Wnt信號通路中關(guān)鍵的信號分子，在BMSCs的神經(jīng)分化中也起到重要的作用。有研究[20]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)BMSCs分化后β-catenin含量升高，為了進(jìn)一步確認(rèn)Wnt/β-catenin在BMSCs神經(jīng)分化中的作用，將β-catenin基因從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中敲除，誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)NSE和巢蛋白(nestin)的表達(dá)都大幅下降。而加入Wnt3a誘導(dǎo)后NSE和nestin都明顯升高。這一研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可能在BMSCs的神經(jīng)分化中起到關(guān)鍵的作用。閻文柱[21]等采用神經(jīng)營養(yǎng)因子堿性成纖維細(xì)胞生長因子分別聯(lián)合Wnt3a和Wnt5a誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化，發(fā)現(xiàn)Wnt3a誘導(dǎo)前后巢蛋白均有表達(dá)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶在誘導(dǎo)后5天明顯擴(kuò)增，10天后更加明顯，而Wnt5a誘導(dǎo)前后巢蛋白呈弱陽性表達(dá)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶呈陰性，這表明Wnt3a能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，而Wnt5a則沒有這樣的作用。

Tsai等[22]在用神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)BMSCs分化的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnts可以通過經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)體系中加入Wnt7a后檢測到突觸標(biāo)志物SYN1、BSN、SYTG以及膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT、多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志物DBH表達(dá)均增加，并證明了Wnt7a對突觸標(biāo)志物的刺激是通過激活經(jīng)典Wnt信號通路完成的。進(jìn)一步用SP600125阻斷JNK信號通路后，ChAT和DBH的表達(dá)完全受阻而MAP2和SYN1的表達(dá)不受影響，這表明Wnt7a通過非經(jīng)典通路JNK來調(diào)控BMSCs分化的具體神經(jīng)元類型。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究仍有一些問題需要解決。首先，BMSCs的免疫標(biāo)志物并不確定，目前采取的逆推法對其進(jìn)行鑒定并不可靠。其次，體外誘導(dǎo)得到的神經(jīng)細(xì)胞雖然可以通過一定的標(biāo)志物來鑒定，但是其是否具有生理功能還需要進(jìn)一步的研究驗證。此外，BMSCs雖然具有多系分化的潛能，但是其分化的效率并不理想，定向分化的條件也不確定，如何高效獲得神經(jīng)細(xì)胞還需進(jìn)一步探究。BMSCs具有來源廣泛、取材簡單、增殖能力強(qiáng)、易于在體外培養(yǎng)等優(yōu)點，在適宜的條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞并且移植后免疫排斥反應(yīng)小，這使其在臨床上治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著很大的應(yīng)用前景。相信隨著BMSCs神經(jīng)分化機(jī)制的深入研究，其臨床應(yīng)用將走上一個新臺階。

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收稿日期:2016-04-03

基金項目:江蘇省六大人才高峰(2014-WSN-076); 揚(yáng)州市“科教興衛(wèi)工程-學(xué)科技術(shù)帶頭人”;

通信作者:楊建東,E-mail:yangjiandong69@sohu.com

中圖分類號:R 329

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-206-03

DOI:10.7619/jcmp.201615079

南通市青年醫(yī)學(xué)人才科研基金資助項目(WQZ2015010)