趙福忠

（黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150038）

牛赤羽病的獸醫(yī)臨診方法

趙福忠

（黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150038）

赤習(xí)毛病（AKA）又稱阿卡斑病。該病以妊娠牛流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、異常產(chǎn)的犢牛，常發(fā)生四肢關(guān)節(jié)彎曲或屈曲，脊柱呈S狀彎曲，不能站立、哺乳困難為特征。引起本病的病毒為布尼安病毒科布尼安病毒屬的辛波病毒群的赤羽病毒。1997年，上海等地區(qū)的一些奶牛場暴發(fā)流產(chǎn)，流產(chǎn)率10～15%，流產(chǎn)胎兒以死胎、畸形、關(guān)節(jié)彎曲為多。1998年從當(dāng)?shù)夭东@的蚊、蝶中分離到12株病毒，其中3株與赤羽病病毒相似，證明我國也有本病存在。

赤羽?。辉\斷；血清學(xué)診斷

1 臨床、流行病學(xué)診斷

1.1 流行病學(xué)

本病毒主要感染牛、綿羊和山羊，可影響妊娠動物胎兒的正常發(fā)育，并能垂直傳染。本病為蟲媒病，主要傳染媒介是蚊和蠓。其流行特點(diǎn)是季節(jié)性明顯，流產(chǎn)和早產(chǎn)從8月份逐漸增多，10月份達(dá)到高峰，以后逐漸減少。死產(chǎn)到次年1月份達(dá)到高峰，流行至5月底停止。異常產(chǎn)多以9月開始至翌年3月為高峰。本病呈地方性流行，但一般同一地區(qū)不連續(xù)發(fā)生。

1.2 臨床癥狀

自然感染或人工感染牛一般臨床上幾乎不呈癥狀。主要危害孕牛，而且多發(fā)生在胎齡7個月齡以上或接近分娩的時期。流行初期，孕牛主要是流產(chǎn)和早產(chǎn)；流行中期，產(chǎn)出的犢牛主要表現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)和脊柱彎曲、歪脖等異常體態(tài)，站立吃乳困難，也可見各種中樞神經(jīng)缺損的犢牛；流行后期，多見死產(chǎn)或無生存能力的犢牛。該病對流產(chǎn)牛子宮損害不大，因此對母牛下次妊娠無大影響。綿羊和山羊的癥狀同牛相似，妊娠綿羊發(fā)生異常產(chǎn)或死產(chǎn)，異常產(chǎn)的羔羊可出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)呈球狀和脊柱彎曲。

2 病理學(xué)診斷

本病毒感染的妊娠母牛，一般不出現(xiàn)癥狀，主要通過胎盤感染胎兒。異常產(chǎn)的胎兒眼況變化為四肢關(guān)節(jié)彎曲、脊柱彎曲、歪脖等異常體態(tài)；流行中期，除多發(fā)關(guān)節(jié)彎曲癥外還多見伴有各種中樞神經(jīng)缺損癥。

3 病原學(xué)診斷

3.1 病料的采集和處理

采集流產(chǎn)和早產(chǎn)胎兒的腦、腦室液、脊髓、肌肉、胎盤以及肝、肺、脾等混合病料研磨后，制成乳劑，取上清液接種細(xì)胞和動物。

3.2 病原分離

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：赤羽病毒可在許多種類的細(xì)胞生長，并產(chǎn)生細(xì)胞病變，如BHK-21、Hmlu-1、Vero、ESK等傳代細(xì)胞，也可在牛、豬、豚鼠等原代腎細(xì)胞生長，其中倉鼠肺Hmlu-1細(xì)胞敏感性最高，并易產(chǎn)生蝕斑。

（2）雞胚接種：將病料乳劑上清液接種于7～9日齡SPF雞胚卵黃囊，如有病毒存在能引起雞胚發(fā)生積水頭癥、大腦缺損、發(fā)育不全和關(guān)節(jié)彎曲等異常，并從雞胚中分離到病毒。

（3）乳鼠接種：將病料乳劑上清液接種乳鼠是分離病毒最可靠的方法。每只1～2日齡乳鼠，腦內(nèi)接種0.02ml，每組病料至少用同窩乳鼠6只。丟棄24h內(nèi)死亡的乳鼠，每天觀察神經(jīng)癥狀，觀察10d。當(dāng)乳鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀時收獲鼠腦。鼠腦毒傳第二代時一般3～5d即可出現(xiàn)癥狀?？勺鳛椴《境醪借b定。

3.3 病毒鑒定

將有病理變化的雞胚或發(fā)病乳鼠的腦組織制成的乳劑接種細(xì)胞BHK21或Hmlu-1，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生病變后，凍融兩次離心取上清液與等量的標(biāo)準(zhǔn)赤羽病陽性血清中和1h后，再接種上述細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞不再出現(xiàn)細(xì)胞病變時，證明該病毒為赤羽病病毒。

4 血清學(xué)診斷

赤羽病血清學(xué)診斷方法有多種。各國根據(jù)各自的情況選用不同的診斷方法，國際上最常用的血清學(xué)方法有微量血清中和試驗(yàn)，瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)由于抗原和每份被檢血清均需用丙酮多次處理，離心洗滌，操作比較費(fèi)事，不利推廣。酶標(biāo)雖然敏感、快速、操作簡單，但在現(xiàn)有條件下不容易控制非特異性的產(chǎn)生。微量血清中和試驗(yàn)因其特異性強(qiáng)、敏感性好、操作比較簡單，為各國首選檢查方法。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)因其方法簡便，特異性好，不需要特殊儀器而被廣泛用于本病檢疫。

下面介紹瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的操作方法及結(jié)果判定。

4.1 材料準(zhǔn)備

器材與試劑：打孔器孔徑5mm，直徑9cm的平皿、顯微鏡、照明燈、50μl微量加樣器及塑料滴頭；瓊脂糖、氫氧化鈉、硼酸、疊氮鈉、抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、被檢血清（按常規(guī)方法采血分離血清，在4℃保存15d檢查有效，-20℃可較長時間保存）和瓊脂糖平板。

4.2 操作程序

（1）孔型圖案的準(zhǔn)備：根據(jù)需要可選用7孔型或63孔型圖案?？讖?nm，孔距3.5mm。（2）把孔型圖案放在平皿下，用打孔器按圖形準(zhǔn)確位置打孔。孔內(nèi)瓊脂用眼科鑷子小心夾出，勿破壞周圍瓊脂。（3）滴加抗原和血清：7孔型，中央孔加抗原，1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，2、4、6孔分別加三份被檢血清。63孔型，按圖“G”孔加抗原，“+”孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，數(shù)字孔加被檢血清（注意每加一份被檢血清需要換1次滴頭）。各孔1次加滿，不得溢出。平皿加蓋后放于室溫（20℃），如室溫較高可將平皿放在濕盒中，24h和48h各檢查1次，檢查時用斜射強(qiáng)光，背景要暗。

4.3 結(jié)果判定

（1）強(qiáng)陽性：抗原孔與被檢血清孔之間出現(xiàn)一條清晰而且致密沉淀線，并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線完全融合，被檢血清判為強(qiáng)陽性，根據(jù)沉淀線的長短，其記錄符號為“+++～++”。（2）陽性：抗原孔和被檢血清孔之間雖無明顯沉淀線，但能使兩側(cè)的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清形成的沉淀線末端向毗鄰的被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲，被檢血清判為陽性，記錄符號為“+”。（3）疑似：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清形成的沉淀線末端向毗鄰的被檢血清孔處彎曲不明顯，而不易判定時，判為疑似，其記錄符號為“±”。可用7孔型重檢，也可將被檢血清濃縮2～4倍重檢，重檢仍為疑似時，判為陽性。（4）陰性：抗原孔與被檢血清孔之間無沉淀線，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清形成的沉淀線直伸到被檢血清孔的邊緣，被檢血清判為陰性，其記錄符號為“-”。

［1］ 馮學(xué)平. 赤羽病的病性流行及其診斷［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，1987，（3）：117.

趙福忠（1971—），男，碩士，大專，主要從事畜牧方面工作。