眼針八區(qū)八穴對(duì)腦缺血再灌注24 h大鼠海馬組織中MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響*

張 威，馬賢德，田維柱

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

眼針八區(qū)八穴對(duì)腦缺血再灌注24 h大鼠海馬組織中MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響*

張 威1，馬賢德2，田維柱△

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

目的:觀察八區(qū)八穴取穴眼針療法對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達(dá)水平的影響，探討八區(qū)八穴取穴眼針療法治療缺血性腦病的部分機(jī)制。方法:健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280±20)g。按體質(zhì)量隨機(jī)分組，分為空白對(duì)照組(8只)、假手術(shù)組(8只)和模型復(fù)制組(24只)。對(duì)模型復(fù)制組24只大鼠采用線栓法進(jìn)行模型復(fù)制，模型評(píng)價(jià)后，篩選模型合格的大鼠進(jìn)行亞組劃分，分別為模型對(duì)照組、眼針對(duì)照組，即分為正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組。眼針組大鼠給予眼針干預(yù)，再灌注即刻以及之后的每8 h進(jìn)行1次針刺治療，至再灌注24 h取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和眼針組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達(dá)水平均顯著升高;與模型對(duì)照組比較，眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達(dá)水平顯著下降。結(jié)論:眼針可能通過抑制p38-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮其腦保護(hù)作用。

八區(qū)八穴;腦缺血再灌注;眼針;p38MAPK;JNK;ERK．

腦中風(fēng)病根據(jù)其病因不同分為缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)。缺血性中風(fēng)主要是因?yàn)槟X血管的狹窄或堵塞而引發(fā)的1組以腦缺血、缺氧為主要癥狀的疾病。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，缺血性腦病的發(fā)病率日益增高。另外，缺血性中風(fēng)的高致死率、致殘率等原因，使人們對(duì)該疾病的防治逐年受到重視。

眼針療法是彭靜山教授于20世紀(jì)70年代首創(chuàng)，應(yīng)用臨床治療缺血性腦病幾十年。后人在應(yīng)用彭靜山眼針療法的同時(shí)，繼續(xù)對(duì)該方法逐步進(jìn)行改善，先后在針刺器具及選穴等方面進(jìn)行了方案的優(yōu)化。八區(qū)八穴取穴方法由田維柱教授提出，該方法取穴更簡(jiǎn)單，更易定位，克服了以往因眼周區(qū)域小而帶來的取穴難以精確的缺點(diǎn)。臨床療效顯示，八區(qū)八穴取穴方法與原八區(qū)十三穴取穴方法的療效并無明顯差異。

本研究擬采用八區(qū)八穴取穴方法對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠進(jìn)行眼針療法干預(yù)，并對(duì)海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，觀察各組間蛋白表達(dá)水平的差異，探討八區(qū)八穴取穴法對(duì)腦缺血再灌注損傷的部分作用機(jī)制，為臨床八區(qū)八穴取穴法的推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280± 20)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)用大鼠購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(遼)2010-0001)。大鼠購入后，于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，給予大鼠常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，隔日更換墊料，自由飲水，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度45%。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施過程中嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則［1］。

1.2 設(shè)備及器材

1.2.1 儀器設(shè)備 37℃恒溫水浴鍋，常州國(guó)華儀器制造廠(SHA-B型)。

1.2.2 手術(shù)器材 手術(shù)器械、縫合針線及手術(shù)敷料由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心手術(shù)室統(tǒng)一提供。釣魚線購自漁具店，直徑為0.25 mm，使用前裁剪成5 cm，一端用細(xì)砂紙打磨成半球形，用黑色油性記號(hào)筆在距離半球形端1 cm、1.8 cm、2.2 cm處做3個(gè)標(biāo)記備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗大鼠P38MAPK、ERK1/2、JNK抗體購自abcam公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280± 20)g。按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組(8只)、假手術(shù)組(8只)和模型復(fù)制組(24只)。對(duì)模型復(fù)制組24只大鼠進(jìn)行模型復(fù)制，模型評(píng)價(jià)后篩選模型合格的大鼠進(jìn)行亞組劃分(實(shí)際剩余18只)，分別為模型對(duì)照組(計(jì)劃12只，實(shí)際9只)、眼針對(duì)照組(計(jì)劃12只，實(shí)際9只)，即分為正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組。

2.2 模型復(fù)制

MCAO模型復(fù)制參照李玉芳等研究方法［2］，對(duì)模型復(fù)制組的24只大鼠采用改良線栓法復(fù)制腦缺血再灌注損傷大鼠模型。假手術(shù)組術(shù)式同模型復(fù)制組，但插入釣魚線的深度僅為0.5～1 cm?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

2.3 模型評(píng)價(jià)

再灌注完成后1 h，待大鼠完全蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。參照ZeaLonga 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］: 0分:無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:大鼠不能完全伸展對(duì)側(cè)的前爪;2分:大鼠向前爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:大鼠向前爬行的時(shí)候向?qū)?cè)傾倒;4分:大鼠不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。被評(píng)為1～3分的大鼠均可納入實(shí)驗(yàn)組，而0分或4分的大鼠因未達(dá)標(biāo)予以排除。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清點(diǎn)各組大鼠死亡情況，計(jì)算各組大鼠死亡率。

2.4 干預(yù)因素施加

空白對(duì)照組不施加任何干預(yù)因素，正常飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取材進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。假手術(shù)組按照上述假手術(shù)模型復(fù)制方法進(jìn)行假手術(shù)模型復(fù)制后，不施加任何其他干預(yù)因素，至再灌注24 h取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。模型對(duì)照組按照上述模型復(fù)制方法進(jìn)行MCAO模型復(fù)制后，不施加任何其他干預(yù)因素，至再灌注24 h取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。眼針組按照上述模型復(fù)制方法進(jìn)行MCAO模型復(fù)制后，再灌注即刻進(jìn)行針刺治療，之后每8 h進(jìn)行1次針刺治療，至再灌注24 h取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.5 樣本采集

各組大鼠于再灌注24 h后斷髓處死，剝離完整大腦浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫固定24 h后轉(zhuǎn)至4℃冰箱中保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2.6 各組大鼠大腦海馬組織中的P38MAPK、ERK1/2和JNK表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK表達(dá)水平。

將固定好的腦組織常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)及去除內(nèi)源性過氧化酶后，采用SP法對(duì)切片中P38MAPK、ERK1/2和JNK的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分別經(jīng)一抗(1∶300)、二抗(1∶500)孵育后DAB顯色，數(shù)碼顯微鏡下采集圖像，采用BI-2000微循環(huán)和醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠腦組織切片的平均光密度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

表1顯示，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果，模型復(fù)制組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，而空白對(duì)照組和假手術(shù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s)

注:*P＜0.01 vs control group;#P＜0.01 vs sham operation group

組別 鼠數(shù)neurological deficit scores Control 8 0.000±0.000 sham operation 8 0.125±0.354 model 18 2.333±0.594*#

4.2 各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

表2、圖 1～4顯示，各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平結(jié)果與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、JNK蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜ 0.01);與模型對(duì)照組比較，眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、JNK蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達(dá)水平比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:#P＜0.05

組別 鼠數(shù)p38MAPK ERK1 ERK2 JNK空 白 對(duì) 照 組 6 0.164±0.022 0.161±0.023 0.153±0.016 0.154±0.013假 手 術(shù) 組 6 0.153±0.026 0.156±0.034 0.154±0.028 0.157±0.03模 型 對(duì) 照 組 6 0.494±0.037* 0.507±0.047* 0.529±0.041* 0.512±0.038*眼 針 組 6 0.404±0.03*# 0.598±0.062*# 0.573±0.027*# 0.401±0.031*#

圖1 各組大鼠海馬組織中p38MAPK表達(dá)

圖2 各組大鼠海馬組織中ERK1表達(dá)

圖3 各組大鼠海馬組織中ERK2表達(dá)

圖4 各組大鼠海馬組織中JNK表達(dá)

5 討論

5.1 八區(qū)八穴取穴法

眼針療法由彭靜山教授首創(chuàng)，并根據(jù)人體眼周穴位分布，將眼周分為八區(qū)十三穴。田維柱是彭靜山的高徒，多年來對(duì)眼針療法有改進(jìn)、充實(shí)、發(fā)揚(yáng)和提高。為提高“眼針療法”臨床療效，近20余年田維柱經(jīng)過不斷學(xué)習(xí)、理解、實(shí)踐改進(jìn)并簡(jiǎn)化了眼針分區(qū)，將原有的“八區(qū)十三穴”合并為“八區(qū)八穴”。多年的臨床應(yīng)用證明，田維柱眼針分區(qū)定穴的有效性和科學(xué)性，簡(jiǎn)化眼針分區(qū)定穴提高了臨床療效，完善并發(fā)揚(yáng)了眼針技術(shù)。

5.2 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路與腦缺血再灌注損傷

研究表明，在線粒體內(nèi)蛋白激酶包括p38MAPK、JNK、ERK1/2以及Raf-l、Src、Fyn、PKA、PKB/Akt、PKC這些蛋白激酶都在細(xì)胞分化和細(xì)胞調(diào)亡中扮演著重要角色，它們可使細(xì)胞調(diào)亡前引導(dǎo)蛋白或抗調(diào)亡蛋白(Bad，Bax，Bcl-xL)發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致電位或信號(hào)的傳導(dǎo)。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些蛋白激酶在線粒體膜內(nèi)外移動(dòng)或存在于在體或離體細(xì)胞線粒體的胞漿中［4-7］，提示這些蛋白激酶在線粒體中進(jìn)行遷移，從而在腦缺血再灌注損傷中起重要作用。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠海馬和腦皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的p38MAPK、JNK、ERK1/2表達(dá)水平顯著升高，提示在腦缺血再灌注發(fā)生的過程中，p38MAPK、JNK、ERK1/2表達(dá)上調(diào)，從而激活p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路造成腦損傷，該研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致［8-11］。而眼針干預(yù)后，p38MAPK、JNK表達(dá)水平得到顯著抑制，而ERK1/2表達(dá)水平提高，提示我們眼針可能通過抑制p38MAPK及JNK的表達(dá)，促進(jìn)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活而實(shí)現(xiàn)其腦保護(hù)作用。

［1］瞿葉清，哈惠馨，郭玉琴．3R原則在醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作中的應(yīng)用［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010，27(6):84-85．

［2］李玉芳，劉坤，倪月秋，等．川芎嗪對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用及Claudin-5表達(dá)的影響［J］．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，6:511-514．

［3］Zea Longa E，Weinsten PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20:84-91．

［4］Wang Z，Chen X，Zhou L，et al．Effects of extracellular signalregulated kinase(ERK)on focal cerebral ischemia［J］．Chin Med J，2003，116(10):1497-1503．

［5］MORI T，WANG X，AOKI T，et al．Downregulation of matrix metallopro-teinase-9 and attenuation of edema via inhibition of ERK mitogen activated protein kinase in traumatic brain injury［J］．J Neurotrauma，2002，19(11):1411-1419．

［6］Pouyssegur J，Volmat V，Lenormand，P．Fidelity and spatio temporal control in MAP kinase(ERKs)signaling．Bioch-em［J］．Pharmacol，2002，64(5-6):755-763．

［7］Walter Koleh．Meaningful relationships:the regulation of the Ras/ Raf/MEK/ERK pathway by protein inieractions［J］．Biochem．J，2000，351(2):289-305．

［8］李浩，張多斌，吳嵐，等．丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠蛋白表達(dá)p38MAPK和MMP-9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響［J］．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，3:229-233．

［9］陳繼興，錢加強(qiáng)，王凌星，等．尤瑞克林對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型p38M APK信號(hào)通路的影響［J］．中國(guó)校醫(yī)，2013，6:439-442+481．

［10］余音．P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用［D］．重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2013．

［11］王?。笫舐阅X缺血后海馬HCN1及p38MAPK的表達(dá)［D］．長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2013．

The Effects of MAPK Signal Transduction Pathway in Rat Hippocampus Pattern of Ischemia Reperfusion in 24h by Eye Acupuncture's Eight Districts 8 Points

ZHANG Wei1，Ma Xian-de2，Tian Wei-zhu△
(1．Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China; 2．Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

To observe the influence of the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus cerebral ischemia reperfusion and to explore its mechanism．Methods:40 male SD rats were randomly divided into control group(8 rats)，sham operation group(8 rats)and model group(24rats)．The line plug method was used to replicate the model in model group．After evaluation，the qualified rats were divided into model group and eye acupuncture group．So the groups were divided as follows:control group，sham operation group，model group and eye acupuncture group．After cerebral ischemia and reperfusion，The rats were treated with acupuncture immediately，then treated with acupuncture at every 8h until to 24h of ischemia reperfusion respectively．Immunohistochemical method detect MAPK three mainly subfamily P38MAPK pathway，ERK1/2 and JNK protein expression．Results compared with the control group，the levels of P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression were significantly increased in the model control group and the eye acupuncture group，compared with the model group，the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus were significantly decreased．Conclusion:eye acupuncture may play a protective role in the p38-MAPK signal transduction pathway．

Eight Districts 8 Points;cerebral ischemia reperfusion;eye acupuncture;p38MAPK;JNK;ERK．

R246．8

B

1006-3250(2016)01-0239-03

2015-06-03

遼寧省科技廳博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(20131073);國(guó)家中醫(yī)藥管理局遼寧彭氏眼針學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(LPGZS2012-09)

張 威(1978-)女，沈陽人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸學(xué)與神經(jīng)病學(xué)和眼針療法的理論與臨床研究。

△通訊作者:田維柱(1942)，男，遼寧海城市人，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事針灸學(xué)與中醫(yī)內(nèi)科學(xué)以及眼針療法的理論與臨床研究。