褚福永 劉 巍 劉紅旭（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010）

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益氣逐瘀方對(duì)急性心肌梗死大鼠miR-24表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的影響

褚福永 劉 巍 劉紅旭
（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010）

摘要目的：觀察益氣逐瘀方參元丹對(duì)急性心肌梗死大鼠miR-24表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法：50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、參元丹高、中、低劑量組，每組10只，采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法復(fù)制心肌梗死模型，參元丹高、中、低劑量組從術(shù)后第2天開(kāi)始給予參元丹藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，共給藥2周。治療結(jié)束后檢測(cè)大鼠血清CK、LDH水平及心肌組織miR-24基因表達(dá)情況，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與模型組相比，參元丹高、中、低劑量組均能顯著降低血清CK、LDH水平（P＜0. 05，P＜0. 01），升高心肌組織miR-24 mRNA表達(dá)（P＜0. 05，P＜0. 01），同時(shí)降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（P＜0. 05，P＜0. 01）。結(jié)論：益氣逐瘀方參元丹能夠減輕心肌梗死大鼠心肌損傷及細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)心梗大鼠缺血心肌組織miR-24基因表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞益氣逐瘀方；參元丹；細(xì)胞凋亡；miR-24

Effects of Shen Yuan Dan on MIR-24 Expression and Myocardium Cell Apoptosis in Myocardial Infarction Rats

Chu Fuyong，Liu Wei，Liu Hongxu
（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：To observe the effects of Shen Yuan Dan（SYD）on MIR-24 expression and myocardium cell apoptosis in myocardial infarction rats. Methods：Fifty SD rats were randomly divided into five groups，namely sham group，model group，high dose，middle dose，and low-dose SYD group，with 10 rats in each group. The myocardium ischemia models were established by ligating of anterior descending branch of coronary artery. The rats in treatment groups were treated with intragastric administration of SYD. The model and sham group were given 0. 9%sodium chloride solution with the same volume. The treatment lasted for 2 weeks. Serum levels of creatine kinases（CK），lactate dehydrogenase（LDH）and MIR-24 gene expression in ischemic myocardium were measured after the treatment. Myocardial apoptosis was measured by TUNEL. Results：At the end of the treatment，the serum level of CK and LDH significantly decreased in SYD（high，middle and low-dose）groups compared with those of the model group（P＜0. 05，P＜0. 01）. And the MIR-24 mRNA expression in ischemic myocardium were significantly increased in SYD （high and middle-dose）groups compared with those of model group（P＜0. 05，P＜0. 01）. Meanwhile，the myocardial apoptosis index also significantly decreased in STD groups（high，middle，and low-dose）compared with those in model group（P＜0. 05，P ＜0. 01）. Conclusion：Yiqi Zhuyu formula SYD could relieve myocardial injury and cell apoptosis in myocardium infarction rats. The possible mechanism may relate to up regulating MIR-24 gene expression in ischemic myocardium.

Key Words Yiqi zhuyu formula；Shen Yuan Dan；Cell apoptosis；MIR-24

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是心肌急性缺血性壞死，是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久的缺血導(dǎo)致心肌壞死，是冠心病的嚴(yán)重類型。細(xì)胞凋亡是心肌梗死早期細(xì)胞損傷的重要病理機(jī)制［1］。近期研究表明，作為細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上游的重要的調(diào)控分子，miR-24能夠通過(guò)抑制靶基因Bim及其下游線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路細(xì)胞因子的表達(dá)抑制心肌缺血早期細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［2］。參元丹是我院心內(nèi)科劉紅旭主任醫(yī)師基于冠心病氣虛血瘀的病機(jī)特點(diǎn)組方而成的特色院內(nèi)制劑，目前在臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病的治療。本研究通過(guò)觀察參元丹對(duì)心梗大鼠心肌損傷標(biāo)志物、細(xì)胞凋亡及miR-24基因表達(dá)的影響，初步探討參元丹通過(guò)干預(yù)miR-24減輕心肌缺血細(xì)胞損傷的作用機(jī)理。

1　材料

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠50只，體重（220±10）g，雌雄不限，購(gòu)自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2013-2014。

1. 2 藥物與試劑 Trizol（Invitrogen）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega），miR-24逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransStart? Green qPCR superMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物設(shè)計(jì)由Invitrogen公司完成，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche）。參元丹由丹參、黨參、玄參、地龍、土鱉蟲等組成，來(lái)源于北京中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室。根據(jù)課題組前期研究資料［3］，將參元丹除去包衣，溶于蒸餾水中，以10倍量常水煮提3次，30 min／次，合并煮提液，濃縮至含生藥1 g／mL的藥液供用。

1. 3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技），全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)BECKMAN），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），ABI 7300 Real time PCR儀（美國(guó)ABI），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus），-80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo），TA1003型精密電子天平（上海天平儀器）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 動(dòng)物模型制備 采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)法扎建立大鼠心肌缺血模型，具體方法參照課題組前期研究結(jié)果進(jìn)行［3］，假手術(shù)組開(kāi)胸后只穿線不結(jié)扎，術(shù)后每只大鼠給予青霉素鈉20萬(wàn)U／日肌注預(yù)防感染。

2. 2 分組與給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁食12 h后進(jìn)行隨機(jī)分組：1）假手術(shù)組；2）模型組；3）參元丹高劑量組；4）參元丹中劑量組；5）參元丹低劑量組，每組10只。給藥從術(shù)后第2天開(kāi)始，連續(xù)給藥14 d。其中，參元丹高劑量組給予參元丹藥液12 g／（kg ·d）灌胃，中劑量組給予參元丹藥液6 g／（kg·d）灌胃，低劑量組給予參元丹藥液3 g／（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組分別給予等劑量的生理鹽水灌胃。

2. 3 標(biāo)本留取 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 mL，分離血清。采血后大鼠麻醉處死，去除心房及右心組織，于結(jié)扎點(diǎn)以下沿心臟縱軸方向分別橫切三份3～5 mm心肌組織，1份置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，另2份分裝入DEPC處理的EP管后放入液氮中，-80℃超低溫冰箱保存待檢。

2. 4 血清CK、LDH檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清CK、LDH水平。

2. 5 心肌組織miR-24 mRNA表達(dá) 采用Real time-PCR法檢測(cè)心肌組織miR-24 mRNA表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。心肌組織總mRNA提取參照Trizol試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，每個(gè)樣本取400 ngRNA模板合成cDNA。miR-24引物序列：上游5′-GCGGCGGTG GCTCAGTACA GC-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6引物序列：上游5′-GCTC GCTTCG GCAGCACA-3′，下游：5′-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3′，PCR反應(yīng)條件：93℃2 min預(yù)變性，93℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，工作40次循環(huán)，最后72 ℃7 min延伸，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)產(chǎn)物的溶解曲線判定引物的特異性。調(diào)整基線和閾值讀出各孔的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，Ct），利用比較Ct法檢測(cè)各樣本mRNA的表達(dá)情況。

2. 6 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，具體按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，正常心肌細(xì)胞核被染成藍(lán)色，凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞核被染成棕褐色，光學(xué)顯微鏡下每張切片選取具有代表性的10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞以及總的心肌細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。2. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，計(jì)量資料組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用ANOVA方差分析，P＜0. 05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3. 1 各組大鼠血清CK、LDH水平變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清LDH、CK明顯升高（P＜0. 01），SYD高、中、低劑量組均能顯著降低心梗大鼠血清CK、LDH濃度（P＜0. 05，P＜0. 01），且呈一定量效關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清CK、LDH含量的比較（±s，n＝10）

表1　各組大鼠血清CK、LDH含量的比較（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0. 01，與模型組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　CK（U／L）　LDH（U／L）假手術(shù)組155. 4±25. 6　176. 6±26. 8模型組　298. 7±23. 1**　374. 5±29. 5**參元丹高劑量組　172. 1±19. 4△△　205. 3±28. 5△△參元丹中劑量組　203. 4±22. 8△△　228. 4±31. 2△△參元丹低劑量組　236. 9±22. 5△　296. 3±25. 3△

3. 2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0. 01），SYD高、中、低劑量組均能顯著降低心梗大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（P＜0. 05，P＜0. 01），且呈一定量效關(guān)系，見(jiàn)表2，圖1。

圖1　各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果（×400）

3. 3 大鼠心肌組織miR-24基因表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織miR-24表達(dá)水平顯著下降（P＜0. 01）。SYD高、中、低劑量組均能夠升高心梗大鼠心肌組織miR-24表達(dá)，其中，SYD高、中劑量組和模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05，P＜0. 01），見(jiàn)表2。

表2　各組miR-24基因表達(dá)情況比較（±s，n＝10）

表2　各組miR-24基因表達(dá)情況比較（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0. 01，與模型組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　miR-24／U6　　凋亡指數(shù)（AI）假手術(shù)組1. 26±0. 13　 1. 45±0. 96模型組　0. 42±0. 12**63. 56±11. 28**參元丹高劑量組　1. 17±0. 09△△　35. 17±15. 76△△參元丹中劑量組　1. 02±0. 14△　44. 25±14. 99△△參元丹低劑量組　0. 64±0. 16　 56. 28±14. 13△

4　討論

細(xì)胞凋亡是一種受基因控制的細(xì)胞自身程序性死亡，其激發(fā)與抑制受多種基因調(diào)控［4］。細(xì)胞凋亡在多種心臟疾病中有著重要意義，無(wú)論是持續(xù)性心肌缺血或缺血后再灌注期均已觀察到明顯的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而缺血早期則以細(xì)胞凋亡為主。

miR是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的進(jìn)化保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制目標(biāo)mRNA翻譯或引起其降解發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控功能［5］。在心血管系統(tǒng)，尤其是一些心肌特異性或高表達(dá)miR，參與了心臟發(fā)育、血管新生、心力衰竭、心肌肥厚以及心律失常等生理和病理生理過(guò)程［6］。近期研究表明［2］，miR-24在哺乳動(dòng)物心肌組織中高表達(dá)，并且在小鼠心肌缺血早期表達(dá)明顯上調(diào)，并可能通過(guò)調(diào)控其靶基因Bim及其下游線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵細(xì)胞因子基因和蛋白的表達(dá)參與了缺血心肌自身修復(fù)過(guò)程；此外，我們前期的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者血漿miR-24表達(dá)水平明顯低于穩(wěn)定型心絞痛和健康人群，隨著冠脈病變支數(shù)和嚴(yán)重程度的增加，miR-24的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，由此可見(jiàn)，miR-24與冠心病發(fā)病過(guò)程關(guān)系密切，miR-24在冠心病心肌缺血發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

本研究表明，心肌梗死后大鼠心肌組織由于缺血缺氧刺激，心肌損傷標(biāo)志物和細(xì)胞凋亡水平明顯升高，而miR-24表達(dá)明顯下調(diào)，參元丹可以有效降低心肌梗死大鼠血清CK、LDH的含量，減輕細(xì)胞凋亡程度，升高miR-24表達(dá)水平，且呈一定量效果關(guān)系。本研究結(jié)果初步驗(yàn)證了參元丹可能通過(guò)調(diào)控miR-24介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路發(fā)揮心肌缺血細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，為下一步研究益氣逐瘀法在心肌缺血細(xì)胞損傷的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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（2016 -02 -24收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

中圖分類號(hào)：R256. 22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 005

通信作者：劉紅旭，主任醫(yī)師，教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究，Tel：（010）52176633，E-mail：lhx_＠263. net

作者簡(jiǎn)介：褚福永（1981—），男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師

基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（編號(hào)：20131107120016）；北京市科委首都特色應(yīng)用專項(xiàng)（編號(hào)：Z131107002213152）；北京市醫(yī)院管理局“青苗”計(jì)劃專項(xiàng)（編號(hào)：QML20150901）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院級(jí)課題（編號(hào)：2014013）