體外心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型損傷及參元丹干預(yù)的影響

楊志海 佟 彤 劉紅旭 尚菊菊 邢文龍 李 享（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科，北京，100010）

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體外心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型損傷及參元丹干預(yù)的影響

楊志海 佟 彤 劉紅旭 尚菊菊 邢文龍 李 享
（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科，北京，100010）

摘要目的：建立體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型，觀察益氣逐瘀組方參元丹（SYD）對(duì)模型心肌細(xì)胞存活率和細(xì)胞損傷程度的影響，以進(jìn)一步探討其改善冠心病圍手術(shù)期心肌損傷的作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，建立缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型并予分組處理，CCK法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率，酶法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量。結(jié)果：模型組存活率低于正常組（P＜0. 05），而CPK、LDH釋放量高于正常組（P＜0. 05）；SYD含藥血清組、PDTC＋SYD組以及PDTC＋空白血清組細(xì)胞存活率均高于模型組和空白血清組（P＜0. 05），細(xì)胞酶釋放量均低于模型組和空白血清組（P＜0. 05），此3組間的數(shù)據(jù)比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：參元丹能夠提高心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型的細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞損傷程度；其機(jī)制可能通過(guò)抑制核因子NF-κB及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)降低細(xì)胞損傷；提示參元丹可能具有圍手術(shù)期心肌損傷的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞冠心?。粐中g(shù)期心肌損傷；體外細(xì)胞模型；參元丹；NF-κB通路

The Effect of Shen Yuan Dan on the Vitro Myocardial Model Cells with Hypoxia／reoxygenation Injury

Yang Zhihai，Tong Tong，Liu Hongxu，Shang Juju，Xing Wenlong，Li Ting
（Department of Cardiology，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：Culturing the neonatal rat myocardial cells'hypoxia／reoxygenation modle in vitro and observe the effects of Yiqi Zhuyu Formula（Shenyuandan，SYD）on the survival rate and the degree of myocardium cells injury biomarkers，and thus to further discuss the its relieving mechanism on PMI. Methods：Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro to establish the hypoxia／reoxygenation model. Then use CCK-8 assay to detect the survival rate and enzymatic assay to detect the levels of CPK and LDH on each cell culture supernatant. Results：Compared with the normal group，the survival rate of the model group is lower （P＜0. 05）and the CPK and LDH release quantity is higher（P＜0. 05）. The survival rate of SYD drug-containing serum group，PDTC＋SYD and PDTC＋blank serum group were higher than those of model group and blank group（P＜0. 05）；serum cell enzyme（CPK，LDH）release quantity are lower than those of the model group and blank serum group（P＜0. 05），while there was no statistical difference among the three groups. Conclusion：Shen Yuan Dan can improve the cell survival rate of myocardial cell hypoxia／reoxygenation injury model and relieve cell injury. This may because it can reduce cell damage through inhibiting NF-κB and its mediated oxidative stress and inflammatory response. It indicates that Shen Yuan Dan could protect myocardium cells.

Key Words CHD；PMI；In vitro cell model；SYD；NF-κB pathway

冠狀動(dòng)脈介入治療（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）已經(jīng)成為冠心病最重要的治療方法并越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于臨床。圍手術(shù)期心肌損傷（PMI）是PCI常見并發(fā)癥。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立體外心肌缺氧／復(fù)氧細(xì)胞損傷模型，觀察中醫(yī)藥制劑SYD含藥血清干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞存活率及損傷程度的影響，并初步探討SYD通過(guò)抑制核因子NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制，以期進(jìn)一步探討其改善冠心病圍手術(shù)期心肌損傷的作用機(jī)制。

1　材料

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，SPF級(jí)，雄性，體重（200±20）g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。（許可證編號(hào)：SCXK（京）2009-0007）；新生Wistar大鼠（1～3 d），雌雄不限，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009）

1. 2 藥物與試劑 參元丹（參元益氣活血膠囊，院內(nèi)制劑，99京衛(wèi)制字［056］第F-2037號(hào)）。將參元丹除去包衣，稱重溶于蒸餾水中，以10倍量蒸餾水煮提3次，每次30 min，合并煮提液，濃縮至含生藥0. 048 g／mL的藥液備用；

Ⅱ型膠原酶（CollagenaseⅡ），Sigma；胰蛋白酶（Trypsin），Ameresco；DMEM／F12混合培養(yǎng)基（Dulbeeeo's Modified Eagle Medium／Nutrient Mixture F-12Ham），Hyclone；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS），Gibco（特級(jí)）；PBS平衡鹽溶液，Sigma；5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromo-2'-Deoxyuridind，Brd-u），Sigma；吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC），Sigma；無(wú)糖Earle's液，M＆C Gene Technology；青霉素-鏈霉素混合液（10 000 U／mL），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)工程研究所；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8），DOJINDO；肌酸磷酸激酶（CPK）ELISA試劑盒，Rapidbio（RB）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；95%N2＋5%CO2混合氣體，由北京中醫(yī)醫(yī)院氧氣站提供。

1. 3 儀器 CO2／O2三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific，3131）；超凈臺(tái)（再鑫，CLASS100）；高壓蒸氣滅菌系統(tǒng)（日本SANYO，MLS-3750）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（重慶萬(wàn)達(dá)公司，CS101-1FB）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma，3-18K）；電子分析天平（德國(guó)，AE200）；激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS，F(xiàn)V1000）；生物分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendof，AG22331）

2　方法

2. 1 含藥血清的制備 將50只大鼠隨機(jī)分為給藥組和空白組，每組25只。給藥組給予參元丹0. 048 g／mL、10 mL／kg，空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥5 d，2次／d，最后一次給藥后1 h對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h后，3 000 r／min離心10 min，無(wú)菌條件下分離血清，將SYD含藥血清和空白血清2組血清分別合并混勻，56℃，30 min滅活，4 mL分裝，封口膜密封，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 2 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 將出生1～3 d的Wistar大鼠固定于泡沫板上，75%乙醇常規(guī)消毒乳鼠胸腹部皮膚。超凈臺(tái)內(nèi)沿乳鼠第3、4肋間眼科剪打開胸腔，眼科鑷取出心臟，至于盛有預(yù)冷PBS培養(yǎng)皿中。剪掉大血管等非心肌組織，反復(fù)清洗4次，將心臟剪成1 mm3大小的組織塊，加入5倍于組織體積的胰酶、膠原酶混合消化液（1∶1比例，胰酶以PBS液配制終濃度為0. 08%，膠原酶以DMEM／F12培養(yǎng)液配制，終濃度為0. 08%），于37℃消化，消化完畢后輕輕吹打組織塊，重復(fù)消化步驟，收集除第一次以外的細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，加入等量的含胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化，4℃、800 r／min離心10 min，棄去上清，輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。過(guò)200目篩網(wǎng)，差速貼壁分離法純化心肌細(xì)胞（90 min）。加入Brd-U抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，以5×105密度種板。細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)，48 h換液后開始正式實(shí)驗(yàn)。

2. 3 細(xì)胞造模及分組給藥 正常培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞，用DMEM／F12培養(yǎng)基同步化，24 h后進(jìn)入造模及分組實(shí)驗(yàn)：先棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，加入預(yù)先以95%N2＋5%CO2混合氣飽和15 min的無(wú)糖Ear1e'S液：1）模型組：三氣培養(yǎng)箱低氧模式（1%O2、5%CO2，下同）中缺氧培養(yǎng)2 h后，用氧氣飽和的DMEM／F12換液后正常培養(yǎng)4 h；2）SYD含藥血清組：缺氧培養(yǎng)2 h后，加入10%SYD含藥血清繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h；3）空白血清組：缺氧培養(yǎng)2 h后，加入10%空白血清繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h；4）NF-κB抑制劑PDTC＋SYD含藥血清組：缺氧培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為10-4mol／L的PDTC和10%SYD含藥血清繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h；5）NF-κB抑制劑PDTC＋空白血清組：缺氧培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為10-4mol／L的PDTC和10%空白血清繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h；6）正常對(duì)照組：不做任何處理，加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)6 h。

2. 4 細(xì)胞存活率測(cè)定及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CPK含量測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)造模給藥后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行加樣操作，用分光光度計(jì)測(cè)得各組OD值。

酶活性計(jì)算公式：

3　結(jié)果

3. 1 各組心肌細(xì)胞存活率的影響 模型組OD值明顯低于正常組（P＜0. 05），而與空白血清組比較未見明顯差異（P＞0. 05）；SYD含藥血清組、PDTC ＋SYD、PDTC＋空白血清組均高于模型組和空白血清組（P＜0. 05）。SYD含藥血清組與PDTC＋SYD 2組均能明顯提高OD值，后者略高于前者，但組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）；SYD組略高于PDTC＋空白血清組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）。見表1。

表1　各組細(xì)胞存活率±s，n＝6）

表1　各組細(xì)胞存活率±s，n＝6）

注：與正常組對(duì)比，＃P＜0. 05；與模型組相比，*P＜0. 05；與空白血清組相比，△P＜0. 05。

組別　　樣本（n）　　存活率（OD值）正常對(duì)照組60. 46±0. 03模型組　6　0. 24±0. 05＃SYD含藥血清組　6　0. 37±0. 06*△空白血清組　6　0. 26±0. 04 PDTC＋SYD含藥血清組　6　0. 41±0. 07*△PDTC＋空白血清組　6　0. 34±0. 04*△

3. 2 各組細(xì)胞上清液CPK、LDH水平 與正常組對(duì)比，模型組在缺氧復(fù)氧過(guò)程中產(chǎn)生明顯的細(xì)胞損傷（P＜0. 05），空白血清組未見明顯的改善損傷作用（P＞0. 05）；而SYD含藥血清組、PDTC＋SYD、PDTC＋空白血清組的藥物干預(yù)均能不同程度改善細(xì)胞損傷（P＜0. 05），但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）。見表2。

表2　各組細(xì)胞培養(yǎng)液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

表2　各組細(xì)胞培養(yǎng)液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

注：與正常組對(duì)比，＃P＜0. 05；與模型組相比，*P＜0. 05；與空白血清組相比，△P＜0. 05。

組別　　樣本（n）CPK （U／L）LDH （U／L）6　 162. 2±16. 9　 188. 4±18. 8模型組　6　 332. 4±22. 3?！?12. 6±24. 6＃SYD含藥血清組　6　 198. 8±19. 8*△277. 4±28. 3*△空白血清組　6　 275. 3±25. 4　 388. 5±22. 7 PDTC＋SYD含藥血清組　6　 177. 6±27. 6*△231. 6±38. 8*△PDTC＋空白血清組　6　 203. 1±20. 9*△278. 3±26. 6正常對(duì)照組*△

4　討論

在PMI發(fā)生的機(jī)制研究中［1-3］，無(wú)論是手術(shù)操作過(guò)程引起的微小血管閉塞、痙攣造成的心肌缺血缺氧，或是缺氧／復(fù)氧、缺血再灌注過(guò)程引起的氧化應(yīng)激、鈣超載、炎性反應(yīng)，均會(huì)造成心肌細(xì)胞的損傷、代謝和結(jié)構(gòu)的破壞，并引起細(xì)胞最終的壞死和凋亡。心肌細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白和各種酶類由于細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)的改變而釋放到細(xì)胞外，其中CPK、LDH以及他們的同工酶對(duì)于心肌損傷的判斷具有較高的靈敏度和特異性。

中醫(yī)藥在改善動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮功能、減輕過(guò)氧化損傷、抑制炎性反應(yīng)、減輕心肌缺血再灌注損傷等方面的功能已經(jīng)得到證實(shí)。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科劉紅旭主任醫(yī)師基于冠心病心絞痛“氣虛血瘀”的病理特點(diǎn)而制成的具有“益氣逐瘀”功效的院內(nèi)制劑——參元丹，臨床上對(duì)不穩(wěn)定心絞痛具有良好療效。我們前期的研究結(jié)果表明［4-9］，參元丹具有改善心肌缺血、減輕缺血再灌注損傷及促進(jìn)內(nèi)源性心肌保護(hù)作用，提示在PMI中可能發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

核因子-κB（NF-κB）是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子上一段10bp的核苷酸序列特異結(jié)合的核蛋白。通常情況下它們都是以二聚體形式和其抑制蛋白IκB結(jié)合在一起，存在于胞漿中，在受到諸如缺血缺氧、機(jī)械損傷、病毒感染、放射線照射等應(yīng)激條件下，NF-κB被激活，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理生理過(guò)程。研究表明，機(jī)體氧化應(yīng)激與NF-κB激活密切相關(guān)，氧化應(yīng)激過(guò)程中活性氧（ROS）大量增加，通過(guò)促進(jìn)具有κB結(jié)合位點(diǎn)的炎性反應(yīng)因子（如IL-6、IL-8、TNF-α等）的表達(dá)參與NF-κB激活過(guò)程［10］。因此，氧化應(yīng)激可能作為始動(dòng)因素，激活NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)通路，參與了PCI后PMI發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（Pyrrolidine Dithiocarbamate，PDTC）為二硫氨基酸酯，具有抗氧化及金屬螯合作用，可以特異性抑制NF-κB活性，有效抑制氧化應(yīng)激所致的NF-κB的過(guò)度表達(dá)，可阻止細(xì)胞因子誘導(dǎo)炎性反應(yīng)遞質(zhì)基因表達(dá)。王云等［11］研究也表明，使用NF-κB激活抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）可使心肌NF-κB活性明顯降低，減輕白細(xì)胞粘附和浸潤(rùn)，缺血再灌注損傷顯著減輕。

綜上所述，抑制PCI造成的過(guò)氧化損傷和炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)NF-KB通路的活性可能是減輕PCI后PMI損傷的重要途徑。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)SYD 和PDTC干預(yù)，檢測(cè)缺氧／復(fù)氧過(guò)程引起細(xì)胞損傷后細(xì)胞的存活率和CPK、LDH釋放量，來(lái)初步探討中醫(yī)藥制劑對(duì)心肌保護(hù)的作用機(jī)制。

CCK-8法以其高靈敏度、低細(xì)胞毒性、方便快捷的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試驗(yàn)。CPK 和LDH作為較穩(wěn)定的細(xì)胞酶，其釋放水平的高低可以反映細(xì)胞損傷程度的高低。本研究中SYD含藥血清組、PDTC＋SYD組以及PDTC＋空白血清組細(xì)胞存活率均高于模型組和空白血清組，細(xì)胞酶釋放量均低于模型組和空白血清組，且結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明參元丹能夠改善損傷后的細(xì)胞狀況，降低細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度。此3組間的數(shù)據(jù)比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SYD的干預(yù)效果略高于PDTC＋空白血清，且SYD和PDTC兩者聯(lián)合干預(yù)效果更好，提示SYD可能具有調(diào)控細(xì)胞缺氧／復(fù)氧過(guò)程中氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用，而這種作用可能與調(diào)節(jié)NF-κB通路的活性有關(guān)，后期實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步研究核因子NF-KB相關(guān)調(diào)控因子的基因和蛋白表達(dá)情況，以更深層次探討SYD在發(fā)揮圍手術(shù)期心肌保護(hù)作用方面的分子機(jī)制。

5　結(jié)論

參元丹能夠提高心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型的細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞損傷程度；其機(jī)制可能通過(guò)抑制核因子NF-κB及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)信號(hào)通路降低細(xì)胞損傷；提示參元丹可能具有圍手術(shù)期心肌損傷的保護(hù)作用。

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（2016 -02 -24收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

中圖分類號(hào)：R256. 22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 007

通信作者：劉紅旭，男，現(xiàn)任首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科主任，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，郵編：100010，Tel：（010）52176633

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81273741）；北京市科委十病十藥項(xiàng)目（編號(hào)：Z141100002214010）；北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目（編號(hào)：KM201310025027）