液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥

饒欽雄，趙 晶，2，閔 紅，邵 婷，4，孫明星，羅 峰，姚春霞

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403；2華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，上海200241；3上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；4安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蕪湖241003；5上海市崇明縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海202150）

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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥

饒欽雄1，趙 晶1，2，閔 紅3，邵 婷1，4，孫明星3，羅 峰5，姚春霞*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403；2華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，上海200241；3上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；4安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蕪湖241003；5上海市崇明縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海202150）

摘 要：建立了有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析方法。取5 g有機(jī)肥樣品以5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH＝4" 0）與20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）超聲提取兩次，用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化富集，以5％氨化甲醇進(jìn)行洗脫，氮?dú)獯蹈珊笠匀芤海ㄈ野罚姿幔?" 66＋0" 74＋100）＋乙腈＝88＋12（V/V）復(fù)溶。以0" 1％甲酸水和甲醇作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式LC-MS/MS檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)肥中4種喹諾酮類(lèi)化合物不同濃度加標(biāo)回收率在66" 19％—115" 00％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2" 40％—9" 45％，檢出限為0" 010 mg/kg，定量限為0" 050 mg/kg，本方法能夠滿(mǎn)足實(shí)際有機(jī)肥樣品的測(cè)定要求。

關(guān)鍵詞：有機(jī)肥；氟喹諾酮類(lèi)；檢測(cè)方法；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；提取劑

氟喹諾酮類(lèi)（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）作為一類(lèi)人工合成高效、廣譜抗菌藥在規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖中大量使用，但其基本不能被動(dòng)物吸收，大部分以藥物原形或其代謝物隨糞尿排出，成為環(huán)境中抗菌藥污染的重要來(lái)源［1］。污染的有機(jī)肥料廣泛施用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，影響土壤肥力、危及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全［2］，還可通過(guò)地表徑流和淋濾作用造成水體的污染，并引發(fā)細(xì)菌耐藥性，進(jìn)而威脅動(dòng)物與人類(lèi)健康；因此，這類(lèi)抗菌藥已成為重要環(huán)境有機(jī)污染物和環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)［3］。近年來(lái)，多數(shù)科研者已用高效液相色譜法進(jìn)行有機(jī)肥中獸藥殘留的檢測(cè)，就目前報(bào)道的方法而言，有機(jī)肥中獸藥殘留檢測(cè)回收率較低，檢測(cè)方法復(fù)雜［4-5］。本試驗(yàn)嘗試用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)有機(jī)肥中4種常見(jiàn)氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥：諾氟沙（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（ENR）。以期為有機(jī)肥中喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

樣品的采集：樣品為雞糞和豬糞，按照GB/T 8571規(guī)定制備實(shí)驗(yàn)室樣品。樣品烘干研磨后過(guò)1 mm或2 mm試驗(yàn)篩。

藥品和試劑：諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）標(biāo)準(zhǔn)品；Na2EDTAMcllvaline緩沖液（pH 4" 0）：0" 1 mol/L檸檬酸溶液∶0" 2 mol/L磷酸二氫鈉溶液＝1000∶625（V/V）；復(fù)溶液：（三乙胺＋磷酸＋水＝0" 66＋0" 74＋100）（體積比）∶乙腈＝88∶12（V/V）；甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純。

主要儀器：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Thermo，Quantum Ultra）；固相萃取裝置（WATERS）。親水親脂平衡萃取柱（HLB）（200 mg，6 mL）；離心機(jī)；超聲儀；氮吹儀。

1．2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜參考條件

液相色譜工作條件：C18柱（100 mm×3" 0 mm（i" d），2" 7 μm）；流動(dòng)相：A相為0" 1％甲酸水溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：0" 3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜參考條件：離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正離子掃描；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓，4" 0 kV；源溫，300℃；毛細(xì)管溫度，350℃；輔氣流速，20 L/h；鞘氣流速，30 L/h；測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表2。

表2　氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的定性定量離子及錐孔電壓、碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ions，cone voltage and collision energy of fluoroquinolones

1．3 樣品前處理

稱(chēng)取（5" 0±0" 02）g試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH 4" 0），渦動(dòng)混勻，再加入20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V），渦動(dòng)2 min，超聲10 min。4 500 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，殘?jiān)偌尤肷鲜鎏崛┲貜?fù)提取1次。合并兩次提取液，用乙腈定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確量取10 mL提取液，置于50℃水浴中氮?dú)獯抵烈好娴陀?" 5 mL（不能吹干），再加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH 4" 0）混勻待凈化。

HLB固相萃取柱使用前用5 mL甲醇和5 mL純水活化，將上述待凈化液以2—3 mL/min的速度過(guò)柱，棄去濾液，用6 mL 30％甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干（5—10 min），再用6 mL 5％氨化甲醇洗脫，并收集洗脫液氮?dú)獯蹈桑? mL復(fù)溶液溶解，渦動(dòng)混勻，過(guò)0" 22 μm濾膜待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2．1 色譜分析圖

在本研究建立的儀器條件下，4種氟喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰十分尖銳（圖1—4），并且均在4 min內(nèi)完成出峰，說(shuō)明構(gòu)建的LC-MS/MS檢測(cè)方法能同時(shí)較好地檢測(cè)出4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥。

圖1　諾氟沙星色譜圖Fig．1 Chromatogram of norfloxacin

圖2　氧氟沙星色譜圖Fig．2 Chromatogram of ofloxacin

圖3　環(huán)丙沙星色譜圖Fig．3 Chromatogram of ciprofloxacin

圖4　恩諾沙星色譜圖Fig．4 Chromatogram of enrofloxacin

2．2 提取劑的選擇

比較了4種提取劑A：Na2EDTA-Mcllvaine（25 mL），B：乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V，25 mL），C：乙腈溶液（含1％草酸）（25 mL），D：A＋B混合液（5 mL＋20 mL），提取有機(jī)肥中氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的加標(biāo)回收率（表3）。結(jié)果顯示D方案加5 mL Na2EDTA-Mcllvaine浸潤(rùn)，后加20 mL乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V）兩次重復(fù)提取有機(jī)肥中氟喹諾酮時(shí)，4種物質(zhì)的回收率均能達(dá)到80％左右，并且重現(xiàn)性較好。故本試驗(yàn)最終采用D作為有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的最佳提取劑。

2．3 線(xiàn)性范圍及檢出限

配制質(zhì)量濃度為0"010 μg/mL、0"025 μg/mL、0"050 μg/mL、0"100 μg/mL、0"150 μg/mL及0"250 μg/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y＝7587" 19X，R2＝0" 9999；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y＝635" 51X，R2＝0" 9999；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y＝3317" 49X，R2＝0" 9998；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y＝6030" 96X，R2＝0" 9998。在空白有機(jī)肥中添加4種氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品，多次低水平添加，以3倍信噪比作為檢出限，10倍信噪比作為定量限，結(jié)果顯示4種氟喹諾酮化合物在有機(jī)肥中的檢出限為0" 010 mg/kg （S/N≥3），定量限為0" 050 mg/kg。

表3　不同提取劑下有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的回收率Table 3 Recovery rates of 4 fluoroquinolones in manure under different extractants

2．4 樣品的加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度

取雞糞及豬糞2種有機(jī)肥樣品作為空白基質(zhì)做添加回收試驗(yàn)。我國(guó)尚未對(duì)有機(jī)肥中氟喹諾酮類(lèi)規(guī)定最高殘留限量（MRL），但肉類(lèi)食品中的MRL為0" 1—0" 3 mg/kg，以肉類(lèi)食品的MRL為參考標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置了0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg、1" 0 mg/kg三個(gè)水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。在雞糞和豬糞兩種基質(zhì)的有機(jī)肥中氟喹諾酮類(lèi)化合物的平均回收率在66" 19％—115" 00％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2" 40％—9" 45％。

2．5 精密度

以空白有機(jī)肥試樣作為基質(zhì)，進(jìn)行0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg和1" 0 mg/kg三個(gè)添加水平，每個(gè)水平重復(fù)5個(gè)樣品，按照上述樣品處理方式操作，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，以測(cè)定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)，3天內(nèi)進(jìn)行3批處理，以計(jì)算日間變異系數(shù)。結(jié)果表明在此方法下有機(jī)肥中喹諾酮類(lèi)抗菌藥的日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)均小于14％。

2．6 實(shí)際樣品分析

市場(chǎng)上收集了9個(gè)有機(jī)肥樣品，用建立的檢測(cè)方法對(duì)其中喹諾酮類(lèi)化合物含量進(jìn)行檢測(cè)（表4）。結(jié)果顯示，在有機(jī)肥樣品中，氟喹諾酮類(lèi)藥物均有殘留。參照肉類(lèi)中的氟喹諾酮類(lèi)的最高殘留量可知，1號(hào)和2號(hào)樣品中諾氟沙星，3號(hào)樣品中氧氟沙星，4號(hào)樣品中除諾氟沙星外殘留均很?chē)?yán)重，超過(guò)MRL規(guī)定值，其余樣品中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥均小于0" 3 mg/kg，但仍有殘留，說(shuō)明該方法能有效用于檢測(cè)有機(jī)肥中氟喹諾酮類(lèi)的殘留。

表4　有機(jī)肥樣品中4種氟喹諾酮類(lèi)殘留含量Table 4 Contents of four fluoroquinolones in manure samples　mg·kg－1

3 討論與結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS測(cè)定有機(jī)肥中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的方法。以往研究多用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，如張敏等［6］運(yùn)用高效液相色譜-熒光方法檢測(cè)畜禽糞中4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥殘留，胡獻(xiàn)剛等［7］運(yùn)用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定畜牧糞便中13種抗生素藥物殘留，該方法也具有一定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，但本研究建立的檢測(cè)方法前處理較之簡(jiǎn)單方便，且該法進(jìn)樣量少，靈敏度更高。用5 mL Na2EDTAMcllvaline和20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）溶液提取有機(jī)肥中殘留目標(biāo)物，得到較好的提取效果，HLB固相萃取柱凈化，具有良好的凈化效果。

通過(guò)對(duì)該方法回收率、精密度、準(zhǔn)確度等的研究，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可為定性和定量分析有機(jī)肥中氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥提供一種準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法。但該方法目前局限于4種氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥的檢測(cè)，對(duì)于其他種類(lèi)獸藥的檢測(cè)尚不明確，可進(jìn)一步探討優(yōu)化該方法用于檢測(cè)其他獸藥的殘留。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］李彥文，莫測(cè)輝，趙娜，等"高效液相色譜法測(cè)定水和土壤中的磺胺類(lèi)抗生素［J］"分析化學(xué)，2008，36（7）：954-958"

［2］吳小蓮，向壘，莫測(cè)輝，等"超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蔬菜中喹諾酮類(lèi)抗生素［J］"分析化學(xué)，2013，41（6）：876-881"

［3］邰義萍，莫測(cè)輝，李彥文，等"長(zhǎng)期施用糞肥土壤中喹諾酮類(lèi)抗生素的含量［J］"中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2010，30（6）：328-332"

［4］王冉，劉鐵錚，魏瑞成"豬糞便中獸藥鹽霉素殘留的降解動(dòng)態(tài)研究［J］"農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（S1）：219-223"

［5］田野，劉善江"有機(jī)肥料中抗生素在農(nóng)田土壤和植物間的遷移研究［J］"安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（8）：4523-4525"

［6］張敏，劉慶玉，敖永華"高效液相色譜-熒光檢測(cè)畜禽糞污中四種氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留［J］"湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（3）：602-604"

［7］胡獻(xiàn)剛，羅義，周啟星，等"固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定畜牧糞便中13種抗生素藥物殘留［J］"分析化學(xué)，2008，36（9）：1162-1166"

（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Determination of four fluoroquinolones in manure by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

RAO Qin-xiong1，ZHAO Jing1，2，MIN Hong3，SHAO Ting1，4，SUN Ming-xing3，LUO Feng5，YAO Chun-xia1*
（1Institute for Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2School of Geography，East China Normal University，Shanghai 200241，China；3Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China；4College of Environmental Science and Engineering，Anhui Normal University，Wuhu 241003，China；5Animal Epidemic Disease Control Center of Chongming County，Shanghai 202150，China）

Abstract：A method of determining 4 fluoroquinolones in manure was developed by liquid chromatographytandem mass spectrometry（LC-MS/MS）" A manure sample（5" 0 g DW）was ultrasonically extracted twice with 5-mL Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution（pH 4" 0）and 20-mL acetonitrile/acetic acid（9/1，V/V），purified and concentrated by HLB solid-phase cartridge and then eluted with 5％ammoniated methanol" The residue was dissolved in the combined solution（triethylamine∶phosphoric acid∶water＝0" 66∶0" 74∶100，V/V/V）and acetonitrile at 88∶12 volumetric ratio after evaporated to dryness under a stream of nitrogen gas" With 0" 1％formic acid-containing water and methanol as mobile phases and via gradient elution，the analyte was determined by LC-MS/MS" The result showed that the recovery rates of 4 fluoroquinolones in different spiked manure samples were 66" 19％—115" 00％with a relative standard deviation of 2" 40％—9" 45％，and the detection limit and quantitation limit were 0" 010 mg/kg and 0" 050 mg/kg respectively，indicating that this method could meet the requirement for determining actual manure samples"

Key words：Organic fertilizer；Fluoroquinolones；Detection method；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Extractant

*通信作者：姚春霞（1976—），女，博士，副研究員，研究方向：土壤和農(nóng)產(chǎn)品安全。E-mail：chunxia" yao＠163" com

作者簡(jiǎn)介：饒欽雄（1979—），男，碩士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全。E-mail：qinxiongrao＠163" com

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201310269）；上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420200）；上海市科委重點(diǎn)支撐項(xiàng)目（14DZ1206303）

收稿日期：2015-06-03

文章編號(hào)：1000-3924（2016）01-056-05

中圖分類(lèi)號(hào)：X713

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A