葛立傲，王國娟，馬煥成，高秀琴，陳夢帆，伍建榕＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；2.國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224）

櫨菊木共生叢枝菌根真菌的分離鑒定

葛立傲1，王國娟1，馬煥成2，高秀琴1，陳夢帆1，伍建榕1＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；2.國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224）

為了解櫨菊木（Nouelia insignis Franch）共生叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的物種多樣性，探明其形成喬木與叢枝菌根真菌多樣性的關(guān)系，野外采集櫨菊木根系及根際土壤，利用土壤濕曬法和根系透明染色鏡檢法，研究叢枝菌根真菌在土壤中的孢子密度及叢枝菌根真菌的侵染率，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對分離的AMF孢子優(yōu)勢菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法初步鑒定出櫨菊木土壤中存在摩西球囊霉（Glomus mosseae）和幼套球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）2種AM真菌；應(yīng)用nested－PCR技術(shù)擴(kuò)增18SrRNA中的NS31－AM1區(qū)，通過序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹A－1真菌與Glomus mosseae（DQ273793）親緣性為97%，A－2真菌與Claroideoglomus etunicatum（AJ510231）親緣性為99%。根據(jù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的雙重鑒定，確定侵染櫨菊木根系的AM真菌是摩西球囊霉和幼套球囊霉。

櫨菊木；AM真菌；nested－PCR；侵染率

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）分布廣泛，能夠侵染90%以上陸生植物根系形成菌根［1］。叢枝真菌能夠提高植物的抗病性、抗旱性和抗逆性等抗性［2］。近年來，叢枝菌根真菌逐漸受到研究者的關(guān)注，以至于在很多真菌學(xué)、植物學(xué)上的研究都要考慮叢枝菌根的影響。胡文武等［3］研究廣州菊科植物叢枝菌根侵染和根際土壤孢子密度發(fā)現(xiàn)，根際土壤孢子密度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。郭世榮等［4］研究發(fā)現(xiàn)，AMF處理顯著提高辣椒植株葉片的凈光合速率、顯著降低蒸騰速率。菊科植物多為草本和灌木植物，只有櫨菊木（Nouelia insignis Franch）單種屬長成喬木。櫨菊木是干熱河谷攀枝花地區(qū)我國特有的單種屬菊科中稀有的木本殘遺種，具有很強(qiáng)的抗干熱性。其能在干熱河谷如此惡劣的環(huán)境下生存，除與植物本身生理特性有關(guān)外，還與植物根際土壤中的叢枝菌根有著不可磨滅的關(guān)系［6］。櫨菊木作為在干熱河谷地區(qū)生長的唯一喬木菊科樹種，但對櫨菊木方面的研究報道極少，尤其是應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究櫨菊木叢枝菌根真菌的報道［5］。

近年來，基礎(chǔ)PCR的各種分子技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于叢枝菌根真菌的研究，而核糖體基因分析為AM真菌屬或種設(shè)計(jì)特異性引物提供了可能［7］。運(yùn)用普通PCR和巢式PCR（nested－PCR）相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)AM真菌在根內(nèi)和土壤中的特異性檢測，為櫨菊木AM真菌的準(zhǔn)確檢測提供技術(shù)支撐［8］。為了解櫨菊木共生的叢枝菌根真菌的物種多樣性，探明其形成喬木與叢枝菌根真菌多樣性的關(guān)系，為櫨菊木的保護(hù)及開發(fā)利用提供參考，筆者利用形態(tài)學(xué)鑒定法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，對櫨菊木AM真菌進(jìn)行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年4月至2016年3月，分別6次在攀枝花干熱河谷地區(qū)采集櫨菊木成株根際10～30cm土層土樣約2 000g放入自封袋中，同時采集櫨菊木成株主根系、側(cè)根及須根，并將部分根系立即放入FAA（70%酒精90mL、福爾馬林5mL、冰醋酸5mL）中保存固定，土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后放入陰涼處風(fēng)干，根樣放入4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 根系侵染

取出根系，加入15%KOH進(jìn)行解離，在90℃水浴中解離2h，自然冷卻，清洗4～5次。加入2%乳酸進(jìn)行酸化20min，清洗4～5次。加入0.05%苯胺藍(lán)（乳酸333mL、甘油333mL、蒸餾水333mL、苯胺藍(lán)0.5g）于水浴鍋中染色1h。染色后用乳酸脫色，最后取出鏡檢［9］。然后計(jì)算AM侵染率，即被侵染的根段長（包括有菌絲、叢枝、泡囊及根內(nèi)孢子的根段）占總根段的比率。

1.3 AM真菌孢子的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定采用濕曬沉淀法將孢子從櫨菊木根際（圍）土壤中分離出來，在雙管解剖鏡下觀察孢子大小、顏色、孢壁的厚度和層數(shù)，進(jìn)行初步分離，待用［10］。

1.3.2 分子學(xué)鑒定

1）單孢DNA的提取。用解剖針挑取單個AM真菌孢子，用無菌水漂洗4～5次，放入高溫滅菌的1.5mL離心管中，加入STL緩沖液200μL，在60℃水浴中加熱15min，每2min渦旋混勻，簡單離心（3 800r／s、20s）；加入蛋白酶K溶液2μL，60℃水浴中預(yù)熱45min，簡單離心，去除離心管蓋子上的水珠，加入Buffer BL溶液225μL，簡單離心；加入無水乙醇225μL，簡單離心，將小收集柱放入2mL收集管中，轉(zhuǎn)移整個樣（包括沉淀）到收集管中，離心（3 800r／s）1min，丟棄下液，用Buffer HB漂洗500μL，離心（3 800r／s）1min棄下層液，將收集柱放入新的2mL收集管中，用Wash Buffer（需用無水乙醇稀釋）700μL漂洗2次，離心（3 800r／s）1min。將收集柱放入1.5mL收集管中，用Elution Buffer 25μL洗脫2次，將收集液于－20℃條件下保存、備用。

2）目標(biāo)DNA片段的nested－PCR擴(kuò)增。分別將上述提取的AM真菌單孢DNA進(jìn)行第1次普通PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍作為第2次PCR模板，進(jìn)行nested－PCR。第1次PCR引物為Geol1：5′ACC TTG TTA CGA CTT TTA CTT CC 3′，GeoA2：5′CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT 3′，第2次PCR引物為NS31：5′TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC 3′，AM1：5’GTT TCC CGT AAG GCG CCG AA 3′。

第1次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，其中，MIX 16.2μL，Geol1 2.5μL，GeoA2 2.5μL，DNA 4μL，ddH2O 24.8μL。反應(yīng)條件：蓋子溫度105℃；94℃4min；94℃30s，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。第2次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，其中，MIX 20.2μL，NS31 2.5μL，AM1 2.5μL，ddH2O 23.8μL，DNA 1μL（第1次PCR產(chǎn)物），反應(yīng)條件與第1次PCR相同。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3）目標(biāo)DNA片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。將PCR產(chǎn)物純化回收由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與西弗吉利亞大學(xué)網(wǎng)站（http：／／www.invam.wvu.edu）上以及NCBI上查詢的序列進(jìn)行比對，采用MEGA 6中的極大似然法對所有序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫨菊木AM真菌孢子的形態(tài)特征

經(jīng)鏡檢，櫨菊木根內(nèi)具有叢枝菌根結(jié)構(gòu)，表明櫨菊木根能形成叢枝菌根。叢枝菌根真菌侵染率越高的樹木生長越好，枝葉越茂盛。櫨菊木土壤中存在大量AM真菌孢子，其中主要優(yōu)勢菌種經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，分別屬于摩西球囊霉（Glomus mosseae）和幼套球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）。

1）摩西球囊霉。孢子圓形或近圓形，淡黃色至黃褐色，直徑250～325μm；有3層孢壁，外層孢壁無色透明，成熟后一般脫落，第2層孢壁淡黃或淺黃棕色，第3層孢壁黃棕色至淺橘黃棕色，連點(diǎn)呈漏斗狀，連點(diǎn)直徑為16～32μm（圖1）。

2）幼套球囊霉。孢子圓形或近圓形，淡黃色或黃色，直徑90～155μm；有2層孢壁，外層孢壁無色透明，內(nèi)層孢壁黃色或黃棕色；未成熟后垣孢子的外壁有完整的連孢菌絲，成熟后脫落（圖2）。

圖1 櫨菊木土壤中摩西球囊霉（Glomus mosseae）的形態(tài)Fig.1 Morphology of Glomus mosseae in N.insignis soil

圖2 櫨菊木土壤中幼套球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）的形態(tài)Fig.2 Morphology of Claroideoglomus etunicatum in N.insignis soil

2.2 櫨菊木叢枝菌根的發(fā)育及侵染情況

對櫨菊木根系透明染色發(fā)現(xiàn)有大量叢枝結(jié)構(gòu)（圖3），表明櫨菊木根系可以形成叢枝菌根。挑選50段根系進(jìn)行觀察，其根系基本均被侵染，其中有泡囊－叢枝結(jié)構(gòu)的47根，櫨菊木叢枝菌根的菌絲侵染率高達(dá)94%。

2.3 AM真菌單孢DNA nested－PCR

經(jīng)普通PCR發(fā)現(xiàn)，由于AM真菌DNA含量較少，在瓊脂凝膠中沒有觀察到DNA條帶。故使用引物AM1、NS31進(jìn)行nested－PCR擴(kuò)增，AM真菌相應(yīng)的特異性DNA序列被擴(kuò)增出來，片段大小為500～750bp（圖4）。

2.4 AM真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

將櫨菊木2種AM真菌擴(kuò)增的DNA序列編號為A－1和A－2，以2個孢子NS31－AM1區(qū)域的DNA序列在GenBank上進(jìn)行blast比對，與相關(guān)菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），A－1和A－2聚成一支，具有較高的支持率。其中，A－1與Gloums mosseae（DQ273793）同源性最高，為97%，初步鑒定A－1為摩西球囊霉（Gloums mosseae）。A－2與Claroideoglomus etunicatum（AJ510231）同源性最高，為99%，初步鑒定A－2為幼套球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）。

圖3 櫨菊木根系的叢枝結(jié)構(gòu)（40×）Fig.3 Arbuscular structure of N.insignis root system（40×）

圖4 櫨菊木AM真菌單孢DNA nested－PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.4 Single－spore DNA electrophoretogram of N.insignis AMF amplified by nested－PCR

圖5 櫨菊木2株AM真菌與其他近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of two N.insignis AMF trains and other closely related species

3 結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種生物分子學(xué)技術(shù)被應(yīng)用到生物物種的鑒定方面。但是叢枝菌根真菌的分子鑒定工作，在國內(nèi)還比較少見。本研究是國內(nèi)首次對櫨菊木叢枝菌根真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子學(xué)雙重鑒定，為今后櫨菊木菌落的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)AM真菌的形態(tài)學(xué)觀察，侵染櫨菊木的AM真菌初步鑒定為摩西球囊霉和幼套球囊霉。后期的分子學(xué)鑒定也為形態(tài)學(xué)鑒定提供了證明。

AM真菌的分離鑒定是保護(hù)以及利用微生物資源最基本也是最重要的工作，AM真菌幾乎可以存在于土壤中任何地方，且具有豐富的物種多樣性［11］。但是，AM真菌與宿主植物嚴(yán)格共生，不能獨(dú)立完成一個生活周期，目前還不能對AM真菌進(jìn)行純培養(yǎng)。因此，對其鑒定工作有一定困難。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外大批學(xué)者開始嘗試從基因水平上認(rèn)識和鑒定新的物種［12］。采用NS31－AM1區(qū)域是真核生物18SrRNA的一部分，其片段較?。s550bp），又是叢枝菌根真菌菌種的種間可變區(qū)域，可以作為叢枝菌根菌種的鑒定依據(jù)［13］。目前，AM真菌分子鑒定的困難之處在于其基因信息數(shù)據(jù)庫不完整，許多菌種和菌株沒有錄入基因信息庫，本研究也通過在Genbank以及西弗吉利亞大學(xué)網(wǎng)站內(nèi)找到相對完整的基因庫來進(jìn)行分子學(xué)鑒定。而且，并非所有的AM真菌都能侵染土壤中的植物根系，同時不同植物品種的AM真菌侵染方式不同。因此，宿主植物與AM真菌共生的關(guān)系具有一定選擇性，通過鑒定，收集，保護(hù)各種AM真菌具有重要的意義。

綜合形態(tài)學(xué)特征及DNA序列比對結(jié)果，侵染櫨菊木的2種AM真菌分別是摩西球囊霉（Gloums mosseae）和幼套球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）。2個AM真菌為櫨菊木中的優(yōu)勢菌種，在其他抗干旱植物上也發(fā)現(xiàn)有共生的現(xiàn)象，說明2個菌種對植物的抗干旱性有促進(jìn)作用，今后可在其他植物上接種，放在相同抗旱條件下對比，測定植物的生物量，為干熱地區(qū)植被的恢復(fù)提供參考。

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（責(zé)任編輯：馮 衛(wèi)）

Isolation and Identification of Symbiosis Arbuscular Mycorrhizal Fungi（AMF）in Nouelia insignis Soil

GE Li’Ao1，WANG Guojuan1，MA Huancheng2，GAO Xiuqing1，CHEN MengFan1，WU Jianrong1＊
（1.Yunnan Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control，College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan650224；2.Southwest Key Laboratory of Biodiversity Conservation，State Forestry Administration，Kunming，Yunnan 650224，China）

The spore density and infection rate of AMF in root system and rhizosphere soil of N.insignis were studied by the soil drying in shade and root system transparency staining microscopy methods anDThe strains with spore superiority of isolated AMF were identified by morphology and molecular biology methods to discuss AMF diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in N.insignis soil and explore the relationship between tree and AMF diversity.Results：There are two AMF species of Glomus mosseae and Claroideoglomus etunicatumin N.insignis soil.The results from amplifying NS31－AM1area in 18SrRNA by nested－PCR show that the homology between A－1fungus and Glomus mosseae（DQ273793）in GenBank reaches 97%anDThe homology between A－2fungus and Claroideoglomus etunicatum（AJ510231）is up to 99%.The AMF to infect the root system of N.insignis are Glomus mosseae and Claroideoglomus etunicatum according to the double identification of morphology and molecular biology.

Nouelia insignis；Arbuscular mycorrhizal fungi（AMF）；nested－PCR；infection rate

Q939.5

A

1001－3601（2016）10－0426－0066－04

2016－06－16；2016－09－20修回

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“干熱河谷區(qū)木棉－叢枝菌根真菌共生系統(tǒng)的水分關(guān)系研究”（31260175），“地生蘭－菌根真菌－松三聯(lián)共生關(guān)系研究”（31360198），“云南熱區(qū)木棉不同基因型的抗旱性比較”（31560207）；云南省高校干熱河谷植被恢復(fù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“干熱河谷木棉定向培育和產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)研究”（2016CYH14）；云南省重點(diǎn)學(xué)科森林保護(hù)學(xué)項(xiàng)目（XKZ200905）；云南省林學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（YN2016）；云南省高等學(xué)校森林病蟲害綜合治理教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（YN2012）

葛立傲（1991－），男，在讀碩士，研究方向：園林植物保護(hù)學(xué)。E－mail：geliaogao＠163.com

＊通訊作者：伍建榕（1963－），女，教授，從事森林病理學(xué)與資源微生物利用研究。E－mail：wujianrong63＠aliyun.com