張文泉，鄧 潔，任 峻

（凱里學院，貴州凱里556011）

珍稀瀕危植物異形玉葉金花愈傷組織的誘導

張文泉，鄧 潔，任 峻

（凱里學院，貴州凱里556011）

為珍稀瀕危植物異形玉葉金花種質(zhì)資源的繁殖、保存與利用提供依據(jù)，以幼嫩葉片為外植體，采用L16（45）正交試驗設計研究不同濃度2，4－D、6－BA、暗培養(yǎng)時間及葉片劃痕數(shù)等因子對異形玉葉金花葉片誘導愈傷組織的影響。結果表明：各因素對愈傷組織誘導率的影響依次為2，4－D＞暗培養(yǎng)時間＞6－BA＞劃痕數(shù)；異形玉葉金花葉片誘導愈傷組織各因素最佳組合為1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，劃痕數(shù)5～7條，暗培養(yǎng)20d。該條件下愈傷組織的誘導率達91.6%。

異形玉葉金花；葉片；愈傷組織；誘導率

異形玉葉金花（Mussaenda anomala Li）為茜草科（Rubiaceae）玉葉金花屬珍稀種［1－2］，1936年在廣西大瑤山首次發(fā)現(xiàn)，1999年8月4日國務院批準為一級重點保護野生植物。2004—2006年，鄧小芳等多次到廣西大瑤山進行考察均未發(fā)現(xiàn)異形玉葉金花；在貴州黔南經(jīng)多次調(diào)査及樣地資料分析后確認，異形玉葉金花在貴州分布區(qū)的植株總數(shù)不超過60株。由于許多原有分布地點已找不到野生植株，也未發(fā)現(xiàn)新的分布地點，加之其種子自然更新能力較差，且易受蟲害，目前全國總數(shù)不超過100株，因此，異形玉葉金花極為稀少而成為一個非常珍稀的瀕危物種［3－4］。

通過組培途徑實現(xiàn)植株再生不僅可以解決無性繁殖的問題，而且可以作為瀕危植物種質(zhì)資源保存的理想試驗體系。以幼嫩葉片為外植體進行組織培養(yǎng)，可為單屬種植物或珍稀瀕危植物的保護提供一條重要途徑，因為葉片來源廣泛又不破壞母株。我國特有的珍稀植物蒙古黃榆（Ulmus macrocarpa var.mongolica）、金花茶（Camellia nitidissima Chi.）和膝柄木（Bhesa sinica）等均通過葉片為外植體獲得了愈傷組織或建立了完整的植株再生體系［59］。迄今為止，國內(nèi)外尚未有對異形玉葉金花進行組織培養(yǎng)的研究報道，因此對異形玉葉金花葉片誘導愈傷組織進行研究，可為建立異形玉葉金花植株再生的試驗體系奠定基礎。鑒于此，筆者于2015年采用植物組織培養(yǎng)方法對異形玉葉金花愈傷組織的誘導及分化進行研究，旨在為異形玉葉金花的回歸種植，種質(zhì)資源遷地保護等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物選取葉齡25d左右的嫩葉為外植體，采自黔東南州林業(yè)科學院溫室大棚的異形玉葉金花當年生扦插苗。

1.1.2 試劑2，4－D，6－BA，0.1%氯化汞（HgC12），75%酒精，蔗糖，瓊脂，MS（基本培養(yǎng)基）的各種元素。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒采回的嫩葉于實驗室中用毛刷擦拭表面后，流水沖洗3h。在超凈工作臺上，先用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗3～5次，再用HgC12消毒10min，無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干，將葉片分割成約1.5cm2的小片，備用。

1.2.2 試驗設計試驗采用4因子4水平的L16（45）正交試驗設計。即：A，2，4－D（0.5mg／L，1.0mg／L，2.0mg／L，3.0mg／L）；B，6－BA（0.3 mg／L，0.5mg／L，0.8mg／L，1.0mg／L）；C，劃痕數(shù)［密（5～7條），疏（4～5條），稀（1～2條），零劃痕］；D，暗培養(yǎng)（5h，10h，15h，20h）。在MS基本培養(yǎng)基中添加3%蔗糖＋6.0g／L瓊脂＋不同濃度激素，pH 5.8～6.0備用。外植體接種后暗培養(yǎng)5～20d，轉入光照培養(yǎng)時其光照強度為1 500lx，時長為全天，用日光燈連續(xù)光照培養(yǎng)，溫度保持（25±1）℃。

1.2.3 測定內(nèi)容將消毒后的葉片用手術刀在背面劃痕，背面與培養(yǎng)基接觸的方式接種于不同處理培養(yǎng)基中，然后置于光照培養(yǎng)箱中按試驗設計培養(yǎng)。試驗共16組處理，每處理接種32個外植體，3次重復。接種后每隔5d觀察1次愈傷組織的誘導情況，接種25d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率，分析不同條件對異形玉葉金花葉片誘導愈傷組織的影響。

愈傷組織誘導率＝（產(chǎn)生愈傷組織的外殖體數(shù)／接種外殖體總數(shù)）×100%

平均誘導率＝［（重復1誘導率＋重復2誘導率＋重復3誘導率）／3］×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；采用SPSS 18.0軟件，通過單變量多因素方差分析，比較各因素對愈傷組織誘導率的效應。

表1 異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導試驗各因素水平Table1 Factors and levels of the orthogonal test for callus induction of M.anomala

表2 不同處理異形玉葉金花葉片愈傷組織的誘導率Table2 Callus induction rate of M.anomalaleaves under different culture conditions

圖示異形玉葉金花葉片愈傷組織的誘導培養(yǎng)Fig. Callus induction of M.anomalaleaves

2 結果與分析

2.1 不同處理異形玉葉金花葉片愈傷組織的誘導培養(yǎng)以異形玉葉金花幼嫩葉片作為外植體，接種培養(yǎng)3d左右葉片局部膨大，10d后均能得到愈傷組織，但愈傷組織出現(xiàn)的時間早晚不一，最早的6d時肉眼可見愈傷組織產(chǎn)生。從圖示可見，16組試驗所得到的愈傷組織由于形態(tài)不同可劃分為2種類型：I型為乳白色，光滑致密，形如小米粒狀，直徑約為5～7mm；II型為淡黃色，疏松，形如水漬，直徑為2～3mm。

2.2 不同處理異形玉葉金花葉片愈傷組織的誘導率

觀察發(fā)現(xiàn)，劃痕密的外植體出現(xiàn)愈傷組織的時間較早，較密劃痕（5～7條劃痕）的外植體在培養(yǎng)第7天時出現(xiàn)愈傷組織，而零劃痕的外植體出現(xiàn)愈傷組織的時間較晚，在培養(yǎng)10d后才出現(xiàn)愈傷組織。從表2可見，接種25d后，各處理均有愈傷組織產(chǎn)生，但愈傷組織誘導率各不相同。受激素濃度、劃痕數(shù)及暗培養(yǎng)時間等因素的影響，處理3、處理4、處理7～10和處理12～14愈傷組織的誘導率均超過70%，其中，處理9的誘導率最高，為91.6%，即當激素濃度為1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA組合，暗培養(yǎng)時間20d，劃痕數(shù)5～7條時，愈傷誘導率最大。

2.3 各因素對愈傷組織誘導效應的檢驗

由表3可知：2，4－D、6－BA、劃痕數(shù)目和暗培養(yǎng)4個因素的伴隨概率p（Sig.）均小于0.05，說明，4個因素對異形玉葉金花愈傷組織的誘導率均存在顯著影響；各因素對愈傷組織誘導率的影響依次為2，4－D＞暗培養(yǎng)時間＞6－BA＞劃痕數(shù)。其中，2，4－D影響最大，影響最小的是劃痕數(shù)。

2.4 暗培養(yǎng)處理愈傷組織的誘導率

暗培養(yǎng)時間4水平的愈傷組織誘導率均值分別為水平1（暗培養(yǎng)5d后光照培養(yǎng)20d）65.43%，水平2（暗培養(yǎng)10d后光照培養(yǎng)15d）72.9%，水平3（暗培養(yǎng)15d后光照培養(yǎng)10d）73.775%，水平4（暗培養(yǎng)20d后光照培養(yǎng)5d）74.975%。由表4可知，暗培養(yǎng)水平4與水平1、水平2、水平3之間的愈傷組織誘導率存在顯著差異，水平1與水平2差異不顯著。所以延長暗培養(yǎng)時間，可明顯提高異形玉葉金花愈傷組織的誘導率。

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑處理愈傷組織的誘導率

該試驗植物生長激素采用生長素2，4－D和分裂素6－BA。其中：1）2，4－D各水平愈傷組織誘導率的均值分別為水平1（2，4－D，0.5mg／L）66.65%，水平2（2，4－D，1.0mg／L）70.83%，水平3（2，4－D，1.5mg／L）79.1%，水平4（2，4－D，2.0mg／L）65.43%。由表5可知，2，4－D水平1、水平2、水平3和水平4之間的愈傷組織誘導率均存在顯著性差異。由此可知，1.5mg／L2，4－D為最佳處理濃度。

表3 各因素對愈傷組織誘導效應的檢驗Table3 Test of different culture conditions for callus induction effect of M.anomala

表4 暗培養(yǎng)處理異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導的差異性Table4 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under dark culture treatment

表5 2，4－D處理異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導的差異性Table5 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under 2，4－DTreatment

表6 6－BA處理異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導的差異Table6 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under 6－BA treatment

2）分裂素6－BA各水平愈傷組織誘導率的均值分別為水平1（6－BA，0.3mg／L）71.85%，水平2（6－BA，0.5mg／L）70.83%，水平3（6－BA，0.8mg／L）70.81%，水平4（6－BA，1.0mg／L）69.8%。由表6可知，6－BA水平1與水平2、水平3、水平4之間的愈傷組織誘導率在0.05水平上均存在顯著性差異，水平2、水平3和水平4之間的愈傷組織誘導率在0.05水平上無顯著性差異。表明，低濃度分裂素可促進愈傷組織生長。由此可知，6－BA濃度0.3mg／L為最佳的濃度。

2.6 不同劃痕數(shù)處理愈傷組織的誘導率

劃痕數(shù)4水平的愈傷組織誘導率均值分別為水平1（0條，無劃痕）63.55%，水平2（1～2條）65.43%，水平3（4～5條）74.95%，水平4（5～7條）78.10%。從表7可見，劃痕數(shù)水平1、水平2、水平3和水平4之間的愈傷組織誘導率存在顯著性差異。其中，較密的劃痕（4～5條）能促進愈傷組織的誘導率。

表7 劃痕數(shù)處理異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導的差異性Table7 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under scratch number treatment

綜上所述，影響愈傷組織4因素的最佳組合是：1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，劃痕較密（5～7條劃痕），暗培養(yǎng)20d后再光照培養(yǎng)5d。

3 結論與討論

該試驗結果表明，異形玉葉金花也能通過組織培養(yǎng)方式實現(xiàn)種群繁殖與保護。

植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控細胞分化和生長的方向與進程，且僅以較低濃度產(chǎn)生各種特殊的調(diào)控作用。其種類、濃度及不同組合是影響植物組織培養(yǎng)的重要因素。2，4－D與6－BA是最常用的生長素類和細胞分裂素類植物生長調(diào)節(jié)劑，二者組合常用于愈傷組織的誘導。圖亞等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中添加0.2mg／L 6－BA＋1.5mg／L 2，4－D用于蒙古黃榆的組織培養(yǎng)，愈傷組織誘導率高達91.6%以上；DALILA Z D等［10］研究發(fā)現(xiàn)，MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA用于玉蕊（Barringtoniaracemosa）葉片愈傷組織培養(yǎng)，其誘導率為100%。莫竹承等［7］研究認為，MS＋1.0mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA為膝柄木葉片愈傷組織誘導的最佳激素組合。諸多研究報道表明，愈傷組織誘導過程中，低濃度激素促進愈傷組織產(chǎn)生，不同激素的組合，不同濃度調(diào)配直接影響外植體的脫分化，甚至起決定性作用；2種激素并用充分體現(xiàn)出組合的優(yōu)勢［12］。與眾多研究［812］結果一致，異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基及激素組合為MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA。

Kintzios S等［13］對Salvia officinalis和S.fruticosa的組培研究結果表明，黑暗的環(huán)境能促進愈傷組織產(chǎn)生，而且較低的光密度有助于胚性愈傷組織形成體細胞胚誘導形成。郭君麗等［14］研究發(fā)現(xiàn)，全光照條件下懷山藥（Dioscorea opposita）葉片愈傷組織誘導率為50%～55%，如果先暗培養(yǎng)一段時間再光照培養(yǎng)，其誘導率達100%，且暗培養(yǎng)時間越長愈傷組織產(chǎn)量越大。林超等［15］認為，暗培養(yǎng)有利于白木香（Aquilaria sinensis）葉片外植體愈傷組織誘導。崔美等［1617］研究發(fā)現(xiàn)，先暗培養(yǎng)再光培養(yǎng)蘋果Malus pumila等植物葉片的組培誘導率均達100%。

該試驗結果表明，暗培養(yǎng)的時間延長有利于異形玉葉金花葉片愈傷組織的誘導，與Kintzios S等［1319］的研究結果一致。由此可知，暗環(huán)境有利于愈傷組織的產(chǎn)生。

對葉片增加劃痕可以增加外植體與培養(yǎng)基的有效接觸，促進外植體對營養(yǎng)物質(zhì)及激素的吸收，從而能夠促進細胞分裂與增殖。關于在葉片背面劃痕促進愈傷組織誘導的報道非常少，具體的作用機理有待進一步研究。

在暗培養(yǎng)時間、劃痕數(shù)目、2，4－D和6－BA等因素中，2，4－D對異形玉葉金花葉片愈傷組織誘導率的影響最大，其次是暗培養(yǎng)時間和6－BA，劃痕數(shù)的影響最小。異形玉葉金花葉片組培誘導愈傷組織最佳條件是MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，葉背劃痕數(shù)5～7條，連續(xù)暗培養(yǎng)20d再光照培養(yǎng)。

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（責任編輯：王 海）

Callus Induction of Mussaenda anomala，a Rare and Endangered Plant

ZHANG Wenquan，DENG Jie，REN Jun
（Kaili University，Kaili，Guizhou，556011，China）

The effect of 2，4－D，6－BA，dark culture days and scratch number on callus induction of young M.anomala leaves by L16（45）orthogonal test design to provide the basis for reproduction，conservation and utilization of rare and endangered M.anomalagermplasm resources.Results：The effect degree of four factors to influence callus induction rate is 2，4－D＞dark culture days＞6－BA＞scratch number.The optimal combination of four influence factors for callus induction of young M.anomalaleaves includes 1.5mg／L 2，4－D，0.3mg／L 6－BA，5～7scratches and dark culture for 20d.Under this condition，the induction rate of callus was 91.6%.

Mussaenda anomala；leaf；callus；induction rate

S567.1＋9；Q943.1

A

1001－3601（2016）10－0434－0102－05

2016－05－10；2016－10－08修回

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目“青錢柳愈傷組織誘導及植株再生研究”［黔科合LH字（2014）7241］；貴州省教育廳優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才項目“異形玉葉金花組織培養(yǎng)研究”［黔教合KY字（2014）251］；貴州省重點學科建設項目“生物學重點學科”［黔學位合字ZDXK（2015）23］；黔東南州科技計劃項目“藍莓愈傷組織誘導及植株再生研究”［黔東南科合J字（2014）4001］；凱里學院校級博士專項課題項目“南方紅豆杉體細胞胚胎發(fā)生及調(diào)控因子的研究”（凱科合BS201338）

張文泉（1984－），男，副教授，從事林木生物技術方面的研究。E－mail：zwq840209＠yeah.net